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大腸菌の発現についておしえて。

1 :帝大医学部生:02/03/14 23:29
あるヒトの酵素を大腸菌で作りたくて、
発現系を構築したけど上手く行かないんだ。
もちろんベクターはあってるし、大腸菌にも導入確認済み。
なのにいろいろ試したけど、全然ダメ。
いれた遺伝子長分のタンパクもできやしない。
RTSもだめ。
どうしたらいいか教えて。
ちなみにN末にタグあり、タグ下に全長つなげてます。

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 23:53
帝大医学部性って山田みたいな?

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 23:57
帝京大ですか?

4 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 01:52
in vitroでの発現系を使うべし

5 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 01:53
うーん、ネタなんだかマジなんだか判別苦しむな。
とりあえず発現も満足に行かない奴は医歯薬板で遊んでもらえ。

それがイヤなら、「タンパク質の精製」スレを探して読め。

6 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 01:55
>>4
RTSが見えないのか?

7 :おくづみ公一:02/03/15 01:57
帝京大のラクビー部ですか?

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 02:07
マジなら「上手く行かない」をもう少し具体的に書いて下さい。
ベクター、大腸菌に関する情報も書いた方がいいでしょう。
酵素の種類や、アミノ酸数も書いた方がいいでしょう。

とにかく、これだけでは漠然としすぎていて答えられません。

9 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 02:11
まじでねたでしょう。

10 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 02:16
専門家がいるタンパク質の精製スレで聞けば事足りると思うが。
わざわざスレ立てんでも、、。

ただ、生物板では稚拙な質問は嫌われるから(まぁ当たり前だが)
>>8が言うように、もう少し答えやすい質問を考えるべきでしょうね。

11 :あほさん:02/03/15 04:48
使用してるvectorと大腸菌の名前を書きなさい。
作られる蛋白が可溶化せずにwesternでdetectできないとか、あとは、
その蛋白が大腸菌にとって毒性を示してるとかもあるし一概にはレスできない。
insertの途中でstopが入るとかの凡ミスはないの?
sequenceをちゃんと確認してみなよ。
抗体が使えるかの確認もとってるのか分からないしよ。
蛋白の立体構造によって抗体が機能しない事も考えられる。


12 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 07:49
上手くいかない理由をちゃんと書けない人ようなだから上手くいかないんだよ

13 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 09:23
うまくいかない理由がわかってたら自分で何とかしていると
思うんだけど・・・。


14 :泥沼歩兵部隊:02/03/15 11:56
ということで詳細がわからないので詳しいコメントはできないけれども、
「ベクターがちゃんとしていて、にもかかわらず発現が全くみられないとき」
私だったらどういうことを想定するかを書いておきます。

(1)ベクターとホストの組合せが間違っている(たとえばDE3が入ってないのに
pETつかってるとか)
(2)ベクターの薬剤耐性と培地の組合せが間違っている。(本当Ampだけ
でいいの?とか)
(3)発現はかかっているが、毒性が強いので、発現のいい菌からさきに
drop outしていく。結果発現しない菌/plasmidを落した菌が生き残る。
(4)毒性は強くないのだが、極端なオーバーエクスプレッションが菌に
ストレスとなって結果的にplasmid drop outを招く

対策 (1)(2)に関しては自分でちゃんと調べること
(3)(4)については低温で培養する、発現誘導を弱くする、培地を変える、
pLysSホストを用いる、lacIq搭載plasmidに載せ変えるなどの
方法があります。

15 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/16 03:24
>14 おお、それそれ。立派なレスだ。
>1はきっとそういうことが聞きたかったに違いない。
他の人、付け加えることない?

16 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 01:07
プレートのコロニー。できるだけ多くを拾って2ml程度の培地で培養して凍結保存しておく。
プレート上で置いておくと、発現している株まで発現しなくなりました。
特に分子量の大きいタンパクを発現させているものほど。
同様の経験したヒト、ほかにはいませんか?

17 :帝大医学部生:02/03/17 02:11
お前ら口だけだな、
お前らに聞いた俺が馬鹿だったよ。

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 04:53
>>17
>俺が馬鹿だったよ。

ようやく気が付いたのね

19 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 04:55
>>18
そのくらいにしとけ
それ以上帝京を馬鹿にすると俺も引けなくなるからな。

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 09:02
某帝大医学系研究科ラボですが、フリークオーターで居着いたDQN医学部生が>>1の状況でハマっています。
他人にものを教わって礼もいえないDQNですが、どうすればよいでしょうか?

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 09:24
>>16
私の場合、恒常的活性型のプロテインキナーゼを持たせた
大腸菌は、プレート上で安定に保持されないことがありました。
グリセロールストックから直に液培に移すと大丈夫だったのに。



22 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 11:08
>>20
つーか東大やね。ほっときゃいなくなるでしょ。

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 19:21
もう少し真面目に考えてくれよ。
ベクターとホストは既製品(インビトロゲン)で、間違えようないし。
RTSでもだめだから、毒性とは思えないし。
シーケンスもあってるよ。
薬剤もAmpとCrmでいいし。
温度、誘導条件もけっこうやった。
そのうえで聞いてるんです。お願いしますよ〜。

24 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 19:44
>23
それだけやってダメならあきらめろ。
発現しないこともあるぞ。



25 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 19:46
>20
君の身元がわかっちゃった。

26 :泥沼歩兵部隊:02/03/17 20:20
>23
(1)RTS(ってロシュのセルフリー系ですか?)でもだめ、ということ
ですが、リボソームに直接毒になるようなケース(RNaseとか)はRTSでも
だめだと思います。そういうときはだまされたと思って小麦胚芽の系
を試すといいかもしれませんね。

(2)実は蛋白質はできているが、非常に微量であって検出に失敗している。
たとえばものすごく沈殿がしやすく、強固なアグリゲーションを形成する
ため、そのあとのSDSサンプルバッファーを入れても、可溶化しない、電
気泳動にかからない。
(3)7回膜貫通型レセプターやその他の膜埋め込み型蛋白質にありがちな、
電気泳動試料調整がトリッキーなケース。たとえば1% SDSではだめ、とか
ボイルするとゲルに入らなくなる、とか2-MEの濃度の問題など。
(4)発現させようとしている遺伝子のmRNAの二次構造が非常に特殊で、
発現がえらく悪い。
(5)4のバリエーションで、たまたま偶然発現させようとしているmRNAが
自己切断活性をもってしまったため、mRNAが分解してしまっている。

(4)(5)はまずありえないと思うのですが念のため。

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 20:35
codon usageを確認してみるとか。
あと、エアレーションが良くないと、極端に発現が悪かったこともあった。

発現させたタンパクを何に使うのかにもよるけれど、これだけやって
ダメだったら、大腸菌にこだわらない方がいいと思うけどなあ。

28 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/18 01:38
1.ベクターを変える
2.大腸菌以外にする

29 :16:02/03/18 08:40
>>21
私の場合は、転写因子と膜タンパクの一種でプレート上に保持すると2-3日で培養しても発現しなくなりました。
同様に、グリセロールストックしたものは大丈夫でした。
以後は30サンプルぐらい、まずストックしてから発現量の多い株を探すようにしています。

30 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/18 23:50
もういい!
バカばっかりだ。
そんなことぜんぶやってるんだよ。
この酵素がないと研究費とれないんだよ。
ボスから言われた事しかしてないソルジャーはこれこれだから困る。

31 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 00:35
>>30
すまん。
>>3の書きこみと発言内容の程度から、
今までてっきり帝‘京’大学医学部生だと思ってた。

いやマジで。

32 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:12
>>30
> バカばっかりだ。

人に色々教えてもらっておいてバカ呼ばわりする君が一番バカだよ。

> ボスから言われた事しかしてないソルジャーはこれこれだから困る。

発現もできないお前はソルジャー以下だね。

33 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:20
>>32はいい事をいった。

34 :泥沼歩兵部隊:02/03/19 01:30
>30
お見それしました。本当に「そんなこと」は全部やっているんですね?
だとしたら、きっと「これはやっていない」ということを確認することを
お薦めします。

適当なキットを使って、IPTG添加後の大腸菌のNothernをやって、
ちゃんとmRNAが全長できているかを是非確認してみてください。
いろいろ理由があるのでRT-PCRはうまく行かないと思います。
最新のキットを使えば可能かもしれませんけど自信ないです。

ここでmRNAの量が少ないようなら、絶望的です。また全長ができ
ていないようなら、ひょっとしたらBL21-STARという新製品の
ホストが役に立つかもしれません。他にもRNAseを欠損させた
大腸菌株が知られています(ほとんどは非売品ですが、いくつかの
ラボにコンタクトすれば分けてもらえます)ので、うまく行かない原因を
mRNAが短寿命であることに絞って改良すればいいのではないでしょうか?

35 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:32
>>32の言う通りだ。
1は死んでしまえ。
お前にやる研究費なんかない。失業して首を吊れ。
無礼、失礼なヤツは大腸菌以下だ。
おっと、これは蛋白さまを発現してくれる大腸菌に対して失礼だった。

36 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:36
ごめんなちゃい。

でも、もし下の学生か、部下が同様の問題で悩んでたら
なんて指導する??
上記の答えじゃあ信頼なくすよ。



37 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:39
>>35
だってくれるんだもん。
君たちには一生当たらないけども。

38 :貧乏ラボ:02/03/19 01:43
>>1
大腸菌はあきらめて、動物細胞発現系でやってみたら?
発現させたい遺伝子の配列をコピペしてよ、無理だと思うけど

39 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:49
>上記の答えじゃあ信頼なくすよ。
そんなにひどい返事ばかりではなかったと思うけど?
特に泥沼歩兵部隊さんのレスは的確で、同じようなことではまっている俺にも参考になったよ。
あと、
>そんなことぜんぶやってるんだよ。
って言い切るくらいなら始めっからそれ全部書きなさいよ。
あんた自身が説明不足だからお望みの答えが返ってこないだけでしょ。
そういうのを逆ぎれって言うんじゃない?
つーか全部ネタじゃないよね?

40 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 02:00
ちょっと言い過ぎたと思うので謝ります。

>>36 基本的に部下の指導はしない。
とこれでは解答になっていないので、確実なポジコン、ネガコンを用意して
@まずウエスタンの系を疑う。
Aウエスタンの系は動いており、かつ数種類のホストで発現していなければcodon usageを確認する。
B問題なければ大腸菌株をトコトン替え、発現株を探す(同時にインダクション等の条件も探る)。
Cそれでもダメならタグ等を取って発現蛋白のサイズをできるだけ小さくする。
Dそれでもダメなら大腸菌をあきらめる。
Eそれでもダメならvivoの発現系を試す。
Fそれでもダメなら発現させるのをあきらめる。
ケースバイケースだが、通常、俺がしている程度のプロジェクトでは
>>34さんの方法まで取って問題解決して発現にチャレンジは多分しない。
違う実験を考える。
例え信頼をなくしても部下には「わからん」と答える。

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 02:05
こんなヤツほって置けよ。
トラブルの説明もできない。
傲慢、礼儀知らず。
人付き合いの仕方をしらないバカ帝大医学部生か何もかもがバカなDQN生物屋かだ。

42 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 02:13
タンパク発現も出来ん阿呆が研救なんかするなー
ほんとーにイ学部生ならとっとと医者にでもなって看護婦でもこましてろー
えらそうに研究者ぶるなー
そのほうが気味にとってもシアワセだろう、忠告してやるよ。

43 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 02:58
>>36
ココは医歯薬板じゃないんだよ。
質問に対する回答一つとっても情報としての価値が全然違うのだから、
もう少し実社会に近い礼儀をわきまえた方が良いと思うぞ。

本当に努力してもなかなかうまく行かなくて困っている奴には、
泥沼歩兵部隊氏のような各分野の熟練者が
有益なサジェスチョンをくれることが往々にしてあるのが生物板。

それなりの礼儀の奴には、それなりの対応になるのは当たり前だわな。

44 ::名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 03:16
>>43
は、非常に良い事を言った。ていうか質問者の最低の礼儀なんだけどな。

45 :発現しないっす:02/03/19 10:03
便乗
ここに配列書き込んだら意見もらえますか?それともその前にこれ使って配列に
妖しいところないか調べとけっていうのありますか?

46 :泥沼歩兵部隊:02/03/19 10:34
それにしても「全く発現していない」のか「微量には発現しているけれども
検出に失敗している」のか「微量に発現していて、沈澱に行っていて
使い物にならない」のかは大違いだと思います。
あと「全長は発現していないが短いフラグメントは検出されている」という
のも状況は別です。
これらの状況の判断は、結局のところ実際に実験している人しか判断でき
ないと思います、ので
1氏は自分ではどのケースだと思っているのか、またその実験的根拠は何か
もう少し具体的に情報をオープンしたらいかがでしょうか?


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