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コロニーダイレクトPCRって 名前: 名無しさん

1 :名無しさん :02/02/09 23:16
コロニーダイレクトPCRって当てになるの?
前回はうまくいったけど、今回のインサートの場合
結果は全部ネガティブ。インサートが入ってないとは
思えない。ちなみにベクターはBLUESCRIPT、プライマーは
T3、T7なのですが・・・

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 23:18
あなたの腕が悪いという可能性は?

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 23:19
ちょこっとだけよ、かきとるの。
かきとるっていうか、チョンとつつくだけ。

4 :1です:02/02/09 23:22
>2
腕が悪いなら、何が問題なんでしょうか。
以前はうまくいったのですが、何か忘れたポイントが
あるのかなあ。

>3
それって、たくさんいれると正確なバンドがでないってこと
ですか?

5 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 23:27
ポジコンは?

6 :1です:02/02/09 23:29
スレッド立てたとたんレスがついてうれしですが、
誰もうまくいかなかった経験ないみたいですね・・・

7 : :02/02/09 23:34
てゆうかポジコン・ネガコンぐらいちゃんとやりなさい。
それで出なけりゃ入ってないの!

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 00:00
>3
何故かバンド自体出ないのよ。

9 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 00:03
滅菌した楊枝なんかでチョンってつつくだけ。
触ったかな?くらいでOK。

10 :>8:02/02/10 01:09
すごく短いバンドはでます。これもコロニー入れすぎの
影響かなあ。

あと、値が今は大丈夫でした。ポジはいれませんでした・・・

11 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 01:28
インサートが入ってないと思えないなら、
ミニプレして確かめたらいいんじゃないですか?

12 :>11:02/02/10 01:32
今晩開始しました。

13 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 02:49
T7&T3 prierの組み合わせはあかんよ
M13の組み合わせにすればコロピーは簡単

14 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 03:06
>>13
T3T7でもうまくいきますよ。

15 :1です。:02/02/10 04:02
もしかしたらinsertを組み込んだ位置からのプライマー
結合部位までの距離なんてのも関係あるかもしれないので
M13でも試してみようかな。

16 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 04:05
俺は爪楊枝で付いた後に、さらに滅菌水で軽くすすいでからPCRにかける。
バンドはきれい。

17 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 04:53
確かにT3とT7の認識配列が似てるためPCRが少しだけ
難しくなるので、自信がないとM13が安全かも。
漏れは、コロニーを植菌したのち、30ulの水に菌をすすいで
3分90度ぐらいで処理して、軽くスピンして上澄を1ul
使ってます。

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 07:16
>16, 17 sonna mendo-kusai koto yatteru no?

Direct-PCR

Point: MUST use AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer/Applied Biosystems)
Do not use Pfu polymerase (Stratagene)
Successful rate- AmpliTaq: >95%
Pfu: 0-30%

Reaction: 20 ml/sample
6 samples 11 samples 16 samples 32 samples
dd.H2O 107 ul 196.6 ul 86.2 ul 572.4 ul
DMSO 6.8 2.4 18 36
10x buffer 13.5 24.8 36 72
Upper primer (200 ng/ml) 1.7 3.1 4.5 9
Lower primer (200 ng/ml) 1.7 3.1 4.5 9
10 mM dNTP 2.7 5 7.2 14.4
AmpliTaq (5 U/ul) 1.4 2.5 3.6 7.2
total 134.8 247.5 360 720

Split 20 ul to each tube. Take colony with tip and transfer E.coli to PCR solution (just rince tip in PCR solution) and then inoculate number-labeled LB-antibiotics plate with same tip.

PCR
94 OC, 2 min
94 OC, 1 min
55 OC, 1 min x 30 cycles
72 OC, 2-4 kb/min
4 OC, ∞

Electrophoresis
Add 2 ml of 10x dye and apply all volume (ca. 22 ml) to 1% agarose-0.5x TAE


19 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 07:23
>>18
Promegaの普通のTaqでもちゃんとできますよ。

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 10:38
TaKaRaの普通のTaqでもできるさ

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 11:27
腕が悪いだけです
グレードが低いtaqでも増えますよ
100個もつつけば慣れます。

あやしいならミニプレ

22 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 11:31
シグマのTaqでもフツーに出来る。
コロニーからでなく培養液からのダイレクトでも増える。

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 11:44
>>4
>腕が悪いなら、何が問題なんでしょうか。
自分でやった実験なのに、失敗原因の候補すら挙げることができないから腕が悪いと言われるのです。
実験は、失敗したら何が悪かったのかを明らかに出来るように組まなくてはなりません。
うまくいってないのに、ポジコンとってないのは最悪です。
コロニーいれすぎも失敗原因として覿面に効いてると思われますが、
インサートが入ってるかどうかも確認してないとすると、なんだかぜんぜんわかりません。

もう一度、プロトコルと自分の材料・手順を確認して、問題点を発見しましょう。

24 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 12:52
つま楊枝の中にPCR阻害物質が含まれているそうな。
TaKaRaだったかTOYOBOのカタログに書いてあった。

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 13:15
プラ楊枝なら大丈夫ってこと?

26 : :02/02/10 14:25
ところでインサートの長さってどれくらいよ?
安物Taqで2kb以上が苦しかったことあり。

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 15:41
>25
普通のパイペット用のチップ(イエロー)を使えば良い

28 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 15:45
I see.

29 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 16:13
>>24
柳のgDNAでしょ?

30 :1です:02/02/10 18:47
>26
確かに2kb近くあります。

>27
私もチップを使っています。



31 : :02/02/10 21:25
takaraのinsert check kitってどのくらい持つのかな?

全く同じプロトコールでやってるのに半年後には
全然増えなくなった。全ての反応時間を増やすと
増えるようになったが、3ヶ月後にはそれですら
増えなくなった。

32 : :02/02/10 21:38
根性 mini prep & sequence の方が早いと思われ。

33 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 22:32
1サンプル10〜15ulで、爪楊枝でかなり乱暴につついた場合(殆ど掻き取っていることもある)
でも綺麗にバンド出るけどなあ。
もっとも、DH5αのような生えるのが遅い菌を使ってるので、コロニーがまだ小さいときにやってるから
多すぎると言うことがなかっただけかもしれない。
(コロニーはPCR溶液に懸濁した爪楊枝でそのまま別プレートにストリークして確保)
使ってるのはTakara Taq。VectorはpBluescript、pCR2.1、pET19bなど。
プライマーはM13とか、T7&T3、T7&T7 terminaterで、30サイクルくらい回して、
PCR産物全部流すと凄く明るいバンドが見られる。

34 :1です:02/02/11 00:33
5mL culture & digestionでinsertが確認されました。
従って、ダイレクトコロニーPCRが動いていなかったことが
判明致しました。

自分のプロトコールで動かなかったことは初めてだし、
まさかinsertが200bpのものも2kbのものも
detectできていないなんて、予想もしませんでした。

いろいろ教えて下さったみなさんありがとうございました。
時間があったらM13でも動かないか確認してみようと思います。

35 :ハ1です:02/02/11 00:58
>18
protocol中のDMSOって必須なのでしょうか?

36 :18じゃないけど:02/02/11 01:07
DMSOなんて、入れたことないけどいつもうまくいく。

37 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 03:29
>>34
なんか、謙虚だね。

38 :>37:02/02/11 04:23
ありがとうございます。
最近生物版でいろんなことをいわれてる女性ポス毒の一人です。
いばらの道を突き進むようだね、なんていわれながら
ここまでやってきました・・・

これからもみなさんよろしくお願いします!


39 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 04:27
ポスドクに男も女もないのじゃ。
忍耐あるのみ。運が回ってきたら「リー即ツモ裏ドラ5」
みたいなのもあるかもしれんし。

>35
DMSOはインサートにGCが多い時に効くことがあります。

40 :1=35=38:02/02/11 05:18
>39
Thank you for your useful information.
I will consider and try it next time when I need to amplify
GC rich insert!

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 05:45
direct-PCRも満足にできないポス毒なんて聞いたことがねえな。

42 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 07:35
爪楊枝は使い捨てたほうがいいかも。
site directed mutagenesisとかしてるときだと、使いまわした爪楊枝
のせいでfalse拾うこともあったようにおもうので。
ちなみに、皆さんのご指摘のようにpfuでない限りどのtaqでもうまくいくと思います。
菌体を入れすぎないのはポイントですね。寒天も入んないように。
寒天入ると反応終了後の液が黄色くなってて欝です。
ちなみに、私は反応vol. 20ul, taq 0.2ulでやってます。
私は33さんとおんなじようにやってます。マスタープレートで
つついた菌を拭う感じで。
自分の経験では2kbぐらいまでならうまく逝った記憶がありますが、
できれば1kb以下に抑えた方がよいように思われます。
菌体とか寒天とか、ゴミが入りやすいぶんPCR増えにくいのではないかと。

役に立ちそうな情報を提供できなかったのでsageます。

43 :18:02/02/11 07:43
ore ha 3.2kb demo ba-cchiri fueru YO!

44 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 07:59
爪楊枝はいつも使い捨てじゃ無いの?
使いまわす必要性なんて全然ないじゃん。
そういえば爪楊枝の元の木の種類によっては
うまくいかなくなるなんて事をどっかのスレで
見たような気がする。


45 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 09:48
Why do you not use sterile tip for the 200P ?

46 :1です:02/02/11 16:25
M13で試してみたらうまくいきました。
今まではT3T7で問題なかったのですが、こんなことも
あるんだと感心しました。
特に13さん、ありがとうございました!

47 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/12 03:22
>>45
Because we don't have enough money, damn it!

48 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/12 19:18
ようじの方が先が鋭いのでコロニーおおすぎの時にはよい。

49 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 00:25
>>32
同感。手間もアルカリSDS処理以外いっしょの操作だし。
古い人間なのかなあ。

50 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 02:02
insertが一つで、しかも両端の制限酵素サイトがstickyなら、
dirct-PCRはしないで、mini-prep -> sequencing。この場合、
colonyは3、4つ拾えば十分。

16個くらいcolonyを拾わないと当りクローンがなかなかとれないとき
(insertが二つ(triple ligation)や、両端がblunt-endなど、
ligationの効率が良くない場合)には、direct-PCRで当りcloneに
目星をつけて、やはりその後はmini-prep -> sequencing。

51 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 02:21
>>

insert長いならEX-Taq使えばあがるよ。
rTaqは腕の悪い漏れには2kbが体力の限界。
ちなみにコロニーPCRであがんないことなんて
無い。悪いのは>>1の腕ではなくてTaqじゃ。
ということにしとけ。


52 :>51:02/02/13 02:33
ありがとうございます。でも、M13なら動いたんです。
インサートとプライマーの相性である、と結論付けたのですが・・

53 :18:02/02/13 02:52
The AmpliTaq is the best DNA polymerase for the direct-PCR using any kinds of primer including T7, T3, SP6, M13, etc.

54 :13:02/02/13 08:15
通常、俺は10uLの系でやってるよ
つまようじは液を吸うのでまず使わないな
コロニーを突くのはクリスタルチップが一番いい
泳動での確認には1ー2 uLの反応産物を使用し、
当たりのクローンは残りの反応液を使ってダイレクトシークエンスへ
腕があがると確認が目的なら5uLの系でもできます
シークエンスを確認してからプラスミドを取りますね、通常わ





55 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 08:21
>13
3 kbもの全長をPCR産物だけでseqするのは無理です。
よって、direct-PCR -> 当りクローン -> mini-prep -> sequencing
が最も効率的なやり方。

56 :13:02/02/13 12:16
ま、せいせい1.2kbのシンサートまでだな

57 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 12:18
すまそ、インサートだった

58 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 13:23
またまたすまそ、せいぜいだった

59 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 23:54
>>58
さては日本人じゃないな?

60 :49:02/02/17 03:02
>>50
うーん、昔なら48本くらいなら平気でminiprepしてたなあ(遠心機16x3回)。
今は96wellで培養→miniprepするからやっぱりPCRはかけない。
最終的にプラスミドが欲しいんだったら。

61 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 19:53
あげ


62 :生きる価値無し:02/03/22 22:56
>>1
俺はM13とreverseでPCRしてる。
250bp付近の小さなバンドしかでないなら、それはno insertでは?
mini prep、次いでdigestionすれば確認はできるでしょ。
colony PCRはinsertとなる遺伝子によってはPCRが走り難い事もあるらしい。
insertが長すぎても無理なはず。
でも、これらが原因ならbandは出ないので、小さなbandがあれば当てはまらない

63 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 01:14
あんたらレベル低すぎ。

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