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livingのGFPの局在って信用できるの?

1 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 11:42
細胞に発現させたGFPってどれくらいの割合で光って見えてるのでしょうか?
livingで見てたときよりGFPの抗体でindirect immunofluorescenceやった時の方が
細胞内の発現量が断然多く見えるのです。
livingではGFPで見るしか方法は思いつかないですが発現されてる蛋白の
一部だけみて局在を語るのは危険ですよね。

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 12:23
最初livingで見るの楽と思って,GFPを使ったんだけど,
いまいち納得できない点があったので,
代わりにmycをつけて染色しました.
GFPではアグっていたのに,
mycだと全然アグらないんですよ.
どうして?

1>とずれていたらごめんね

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 13:07
GFPでみるのは簡単だし世の中的に本流でありそうだから
GFPでいいんじゃないかな。
とりあえず、第1の選択としてさ。

4 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 13:15
>>1
間接での蛍光がすべてポジティブと言えるのか?
(×蛋白 → ○タンパク質)

5 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 15:05
GFPは嫌いだ。

6 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 15:40
liveのGFPでの局在は信じたい・・、
けど正しいという保証はないだろうね。
まあ固定して抗体で見たって固定によるartifactもあるから一長一短でしょう。

それよか、RFP fusionって試した人いるの?
4量体作るっていうけどあれってvivoでもそうなのかなあ?
DsRed2自体はめちゃくちゃ明るいから結構いけそうな気もするんだけど。


7 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 20:58
Dsred2の方がGFPよりあかるいのですか?
GFP imagingってよく本がでてるけどDsRed2ってあんまり見かけないですよね。
なぜなんでしょ?

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 21:12
ttp://www.clontech.co.jp/info/july01/pdf/2001-07-Dsred2.pdf
ここみたら載ってた。あんまりよくなさそう。

9 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 04:43
宮園さんとこの人だったと思うけど、ヴィーナスてのを作ってたぞ。
要するに構造を安定化したGFPらしい。
それで明るくなったし、発現から発光までのタイムラグが短くなったそうだ。
逆に考えれば現行のGFPは結構光らない割合が高いんだろうな。>>1

10 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 05:05
理研の宮脇さんじゃなくて?

筑波の薬理では、DsRed2よりもすぐれたタイプの変異型RFPの作製に成功してるみたい。

11 :9:02/02/07 05:23
>>10
そ、そ、失礼。
帰ろうと玄関まで行ったところでポスター見て間違い気づいて
戻ってきたところだよ。でも遅かったか(w

12 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 11:02
4量体だよ。
だいたい細胞生物やってるひとって蛋白質のストイキオメトリに対して
無頓着な人が凄く多いよね。そんなことじゃこの学問いつまでたっても
進歩しないで、顕微鏡会社にお金を流し込む単なる金ヅルの分野になっちまう。

13 ::02/02/07 11:54
>>9
おお、ありがとう。早速宮脇先生のペーパーよんだよ。
このFig2のとおりになったんですよ。
今度からVenusつかおっと。

14 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 12:26
>>11 戻ってきた、、
律儀ですな。


15 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 12:31
FLAGタグつけて細胞染色やってんのだけど、
GFPのほうが楽っぽい・・・

16 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 12:43
蛍光強度で発現量をうんぬんするなよ>1
それとも局在が違ってたのか?それならその疑問も判るけど。
GFP-fusionは局在だけでなく機能もintactではなくなってる可能性があるから
気を付けた方が良いのは確かだよ。
GFP-actinとかのベクター売ってるけど細胞の挙動があからさまに怪しくなる・・・・

17 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 15:30
GFP免疫染色やってるんだけどなかなか反応でなくて、困ってます。
良い固定方法、凍結切片作成法、免疫染色のコツを教えてください。
あと、参考文献とか。
よろしく御願いします。

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 21:43
>>GFP-actin
只今GFP-actinの導入検討中。
どのようにおかしくなるのか、詳細キボンヌっと

19 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 02:34
良い抗GFP抗体ってありますか?
できれば、コマーシャルに手に入るもの。

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 02:39
IHCするんならもうGFPなんか使わんでよいのでは?

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 03:00
Tagに対する抗体のように使える良い抗GFP抗体は
ないって聞いた事がある。光らせて見る以外は
他のTagに替えて実験するのが正しい道らしい。
本当かなあ?


22 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 04:51
>>19
MBLのポリクロ。
ウェスタンでバックが出ないので吉。

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 04:56
そんなことないです。GFPもちゃんと市販の抗体できれいに染まります。
モレキュラープローブの抗体(ラビット、マウス)がおすすめですね。
あとケミコンのチキンの抗体もまあまあです。他はぜんぜんだめ。
固定方法は、PFA4%でいけます。メタノール固定などでは、
GFP蛍光が消光し、同時に上記の抗体に反応しなくなるんで注意。

24 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 05:25
FRET!!

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 08:28
>>1
しかし、なんでGFPをICCしようとしたんでしょうか?
しろーとの私には解せぬ。

>>23
GFPはメタノール固定で消光するんですか、、、。
勉強になります。

誰かに知ったかぶって言ってみます。

26 :1:02/02/08 11:13
最初大腸菌でGFP fusion蛋白発現させたらWBではバンド見えるのに緑に
光らなかったのでGFPって発現してても光らないときあるんだ、と気づいたから。
結局大腸菌はinduction20℃なら光った。37℃だと光らない。

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 11:31
>>18
増殖が極端に遅い&多核のものが高頻度で出現(細胞質分裂の異常か?)
運動が遅い(様な気がする)

てな訳で、局在はnativeと同じだが、ターンオーバーが遅いのでは?
と疑っている。

28 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 20:46
1 GFP fusionでの観察ではタンパク質の細胞内局在が変わる可能性がある。
2 そのため、nativeのタンパク質に対する抗体で予めタンパク質の局在を決定しておく必要がある。
3 それならハナからGFPなぞ使わんでも・・・

はて?

29 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 21:42
>>28
ではどうやって生きてる細胞の中のタンパク質の挙動を観察すればよいんじゃろ?

30 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 23:24
>>29
ずばり、免疫電顕のみ。

31 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 00:34
>>30
生きてないだろ!


32 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 05:30
蛍光物質で精製したタンパク質をラベル、マイクロインジェクションで入れてしばらく待つ。
うまく機能構造体取り込まれればOK
チューブ林などでは成功している。

33 :30:02/02/09 16:31
>>31
逝ってくるぜ、ベイベー・・・・

34 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 17:27
>>28
だから最近の分子生物屋は・・・
GFP-fusionは局在未知のタンパクの局在を知るのに使うんじゃなくて
局在既知のタンパクの生細胞内での挙動を知るために使うんだよ。
いろいろな状態の細胞の固定標本でのnativeなタンパクと局在が
一致してるから、動態も正しいと推測されるんじゃないか!

35 :28:02/02/09 17:45
>>34
いやおっしゃるとおりで異論ないのだが、世間には局在未知のタンパク質にGFP標識している例も多くありかと・・・

36 :34:02/02/09 17:51
GFPでしか局在を見ていないなら俺は眉に唾付けて見とく。
核内とかER、ゴルジだったら特に。

37 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 02:40
GFP自体は安定な蛋白だそうですが、turnoverの短い
蛋白と融合させた場合、GFP部分だけが残ってしまう
ことはあるのでしょうか?それとも一緒に分解される?
初心者の質問ですみませんが、教えて下さい。


38 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 07:54
37> cycline DなどはGFPごとproteosomeで分解される。

ヒストンH2Aや H1、PCNAなど高次構造にとりこまれるもの、
形成するもの、でもGFP fusionがうまくいっている例はたくさんあるし、
GFPうんぬんよりも、過剰発現系そのもののアーティファクとの
問題とおもわれ。
ただ tagの蛍光抗体法は、triton NP-40などでよけいなものが荒いながされるから、
本来の過剰発現よりも構造体に結合しているものが浮かび上がってくるので、
生でみるGFPよりもよけいな議論がすくない。


39 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 10:22
>>38
そう言えばそうだ。過剰発現によるアーティファクトがまた問題なのだ。

40 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 23:54
yeastならmutantのcomplementationでfusion proteinが
wildと同じように働くかが分かるから楽なのに。

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/27 03:49
>>40
それはwildとおなじところに存在することは示せるが、
wildと違うところにもある可能性は除外できない。

42 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/27 17:23
ま、しろうとは抗体つくってそめなってことさ。

43 :親切な人:02/02/27 17:35

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44 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/27 21:16
>>37
ユビキチン化されればプロテアソームでまとめて分解されるのでは

45 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/13 00:24
GFP

46 :あていこん:02/03/15 18:48
ちょっと聞きたいんですけども.
EGFPよりも蛍光感度の強いGFPってありますか?教えてください.

47 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 20:32
理研脳科学が今年の初めに出したやつは?
Nature Biotech

48 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 03:07
ビーナスですか?

49 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 03:56
あー、それそれ。
ビーナスってどうよ?
毒性とかについても情報きぼんぬ。

50 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/09 02:53
ビーナスあげ

51 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/09 04:59
論文読めよ

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