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RNAiってどうよ

1 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 09:48
少し話題になっているよね。実際にちゃんと機能しているのだろうか?この関係の実験している方などからの情報お願いします。

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 11:00
RNAiって何ですか?

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 11:10
RNA interference

antisense RNAを導入すると、sense鎖にコードされてる
タンパク質ができなくなる。

メカニズムについては現在研究中。sense鎖にhybridize
したdouble strand RNAが分解されてその分解産物が
さらに…。
面倒なので何か適当な論文でも読んでくれ。

4 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 11:14
2>
逝ってよし。

5 :2:02/01/09 11:21
4>
じゃあ、おまえAAA ATPaseってわかるか?

6 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 11:23
>>3

アホ一匹みっけ!!
この時代にRNAiとantisense RNAを混同している奴がいる!
無形文化財クラスの馬鹿だなあ!

7 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 11:37
まあまあ。外来の二本鎖RNAで内在性のsense RNAが分解されるのがRNAiね。

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 11:38
>>6
いや、べつに混同してる訳じゃなくて、
説明が下手なだけだろ。
antisenseのきこうの一つがRNAiなわけだし。

9 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 11:39
外来とはかぎりませんよ
内在のRNAiだってあるんだから

10 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 11:40
むしろ、今は内在のほうが興味深い。

11 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 11:56
>>6
>説明が下手なだけだろ。
antisenseのきこうの一つがRNAiなわけだし。

全然違うんじゃないの?
RNAiってdicerがdsRNAに結合して、21-22bpのdsRNAに分解し
それがleader役になってtargetRNAに結合して、この複合体に
さらに、ENDのRNaseが結合して分解するんだよ。
antisense RNAとは違うよ!

12 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 12:31
>>11
君はもう少し、antisenseについても
勉強したほうがいい

13 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 13:03
誰も試していないんだな。
さすが2ちゃんねる。

14 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 13:09
antisense RNAがsense RNAと2本鎖を形成することで翻訳を阻害する
とは言われているけど、証拠を示した論文て見たことないなぁ。結果的
にantisenseも同じメカニズム使って翻訳阻害していんじゃないの?学
会で数年前にそんな話を聞いたこともあるし・・・。

15 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 13:11
RNAiのiはinternetのi

16 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 13:38
>14
そんなことを書いてあるreviewを読んだことがあるが、結局そちらも
証拠はないように思う。

17 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 13:45
>>12
君はもう少し、antisenseについても
勉強したほうがいい

じゃ、お前少し解説して見ろよ!
antisense RNAで
RNAi複合体ができるなんて聞いたことないぞ!
もしあるならば論文キボーヌ

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 13:53
DNAiってどうよ?

19 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 14:11
>>17

12はなにも知らないのに、知ったかぶりをしているだけだ。
相手にするな。

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 14:31
あの定期的に立つRNAiスレか。
わたしがこの伝説を聞いてから3つめだが、
実際いくつぐらいあったのだろうか。

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/09 15:28
ホメオボックスが細胞外に分泌される話はどうなった?
FGFが細胞内因子って話はどうなった?
カリウムチャネルが核内に局在って話はどうなった?

22 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/10 03:47
QPコーワiってどうよ?

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/10 10:36
RNiって線虫では盛んに使われています。だってベクターをえさの中に混ぜるだけでいいから
RNiの機構は2年前くらいにCellのminireviewで取り上げられてます。

24 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/10 10:38
RNAiの発見って、ノーベル賞ものなの?

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/10 14:48
実験に使用している短鎖の合成RNAってどこに注文しています?
自分で合成?

26 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/10 17:42
なぜ短鎖RNAが必要なの?
折り返しの配列を入れたベクターを使うでしょ。

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/11 18:31
ところで、RNAi見つけたFireって若いの?

28 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/11 19:25
>>26
c.elegansなら折り返しでいいんだけどmammaliaではだめなの。

>>25
俺は自分で合成している。

29 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/11 19:47
これについてまったくの素人なんですが、
去年の分生に現れた外人さん(なんていう名前だっけ?)、
十二年ぶり来日のあの人がRNAiの第一人者?
どのような系で導入するの?
たとえば、生体に短鎖RNAを導入した場合、
遺伝病のサイレンシングを起こすことできるの?

30 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/11 21:42
>c.elegansなら折り返しでいいんだけどmammaliaではだめなの。

動物細胞ではIFN kinaseが活性化されバルクの転写がブロックされ
使えないんだよ!だからオリゴ21bp dsRNA

31 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/11 23:03
>>27 そんなに若くない。と言ってジジイでもなかったような

>>30 C.elegansも動物なんだが・・・

32 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/11 23:57
以前の論文では、mammlianではRNAiは完全には抑えない(1/10程度)
と有りましたが、実際に試した方いかがでしょうか?

33 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/12 09:13
RNAi、humanのculture cellでも良く効くぞ!
こいつに比べればantisenseやRibozymeなど問題外だ。
でもPKRには気をつけろよ!
とりあえず21merのRNAを2本合成して細胞にぶちこんでみろ>おまえら。

34 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/12 10:00
PKR を RNAi しちゃたらどうよ?

35 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/12 10:47
結局、ターゲットの遺伝子によって効きが違うとかね。

36 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/12 11:06
>32
線虫などでも完全に押さえているわけではなく、多少の漏れはある。

37 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/12 11:40
つまんねえ、やめろ。

38 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/12 17:26
>>35
それがないからRNAiはantisenseやribozymeよりイカしてるんだよ。
標的遺伝子にほとんど左右されないというのは強力だぞ!

39 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/13 02:50
>>38
しょせん目くそ鼻くそだよ。
knock-outや、mutantの原因遺伝子の単離にはかなわない。

サイレンシングの手法よりも、
内生のRNAiのターゲットとか、メカニズムの方が100倍おもしろい

40 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/13 04:47
>>39
五十歩百歩には同意。
というか遺伝子によって効果に違いが少ないという話は初耳です。
pubmedIDおしえてください。>>38
でも興味の方向はひとそれぞれだね。
俺もRNAiを利用した内在性の遺伝子制御機構がおもしろいとは思うけど。

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/13 05:06
少なくとも線虫では完全に日常的ツールになっているんだけどなあ。
KOをやる前にRNAiを試してみるのは常識だし、
mutantをとらずにRNAiだけで解析している論文は山のようにある。
下手すりゃ半分くらいそうじゃないかってくらい。

要は「ナントカとはさみは使いよう」でしょう。
ここでは哺乳類の培養細胞の話をしているんだと思うけど、
「機構の研究の方がずっと面白い」なんて、もったいないこと言わずに、
もっと気軽に日常の実験にうまく取り入れていくことを
みんなでガンガンやっていった方がいいと思うよ。

思っているよりもずっと使えたりするかもよ。

42 :40:02/01/13 05:23
だね。
とりあえずやってみたらいいよ。
手軽さが売りのRNAiなんだから。

43 :38:02/01/13 09:29
>>40
とりあえず自分の比較実験の結果を述べたまで。いろいろやってみたよ。
詳しいことはいえないが…まあうまくまとまったら論文にするよ。

>>41
君、なかなかいいこというな!

44 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/13 12:39
みんな、日曜の朝からご苦労様。
たしかに、戦中では日常的ツールですね。
他の生物種ではどうなんですか?

45 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/19 07:27
ES細胞では長いのをいれると、都合良く短く切れて効くらしい。

46 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/19 14:54
>>ES細胞では長いのをいれると、都合良く短く切れて効くらしい。

動物細胞では、NCBのデータは否定されたよ。
だからoligomerを使う方法になったんだ

47 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/19 17:52
>>46
コメントありがとう。
MCBとPNASにも載ってたので、応用できるのかと
勘違いしました。(活字は怖い)
Oligomerの場合、トランスフェクションはどうするの
でしょうか?まさかエレガンスみたいに食べ込んだり
はしてくれないでしょう・・・・

48 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/20 16:55
直接Mediumに入れるのかと思っていたが、siRNA用の
トランスフェクション試薬ってのもあるらしい。



49 :46:02/01/20 17:14
>>47

普通のlipofectaminでよろしい。
oligofectaminちゅう特別な奴も売り出されているが、
結果は変わらんかった。
どれくらいノックアウトされるかというと、これはtarget proteinの
turn overによるんだ。
cell cycle geneを潰しているが、これまで6個潰してほとんど成功した。
Westernでほとんど検出不可能なくらいなくなる。

50 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/20 17:43
よっしゃ、早速やってみよ!
と思ったが、RNAの合成って外注できます?

51 :46:02/01/20 18:10
すんません。わしゃ、アメリカ在住で日本の事情に疎いので
ようわかりません。
これは RNAだけではなく末端をTTのDNAにしてRNaseのアタックを
防御するようにしてあるので、特注となると思います。


52 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/21 15:25
RNA−DNAのキメラ合成、日本でもやってるよ。探してみぃ

53 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/23 16:31
日本バイオサービスでやってるよ。

54 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/23 16:44
21merぐらいがいいのなら、少し面倒だが、相補部分を21merにして
それらの間にスペーサーでもかますコンストラクトを作るというのは
どうでしょう。こうして、正常sense鎖と、コンストラクト由来の
antisenseを合成して、RNaseAで処理後、精製。
やっぱり面倒だ・・・・

55 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/23 23:59
たしかに面倒だね。
あと3'の突出が効率に関係するはず。
やっぱ外注が楽では?

56 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/24 01:29
>>55 3'が突出していた方がいいの?

57 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/25 00:38
PMID: 11157775
>>56ハエだけど。
38さんの場合どうでした?よろしかったら。

58 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/26 16:46
Mammalianの系での成功談もお願い。
効率ってどのくらい?ハエの場合インジェクションで
phenotypeが出ると聞きました。

59 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/26 21:45
HPLC精製した方がいい?

60 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/29 03:43
Morpholinoって誰かうまくいってる人いますか?

61 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/29 14:25
おれはマウスにできたとある腫瘍にうってみてうまくいったぞ。いま論文サブミットちゅうだが。。。

62 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/29 16:25
>>61
Morpholinoですか?vivoで撃って効くのなら最強だ!

63 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 02:01
ぶちかませ。
日本のライフサイエンスをせかいにしらしめるのだ。

64 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 04:28
>>63
恐る恐る聞きますが、Morpholinoって日本の発明ですか?
(ああ、非国民と呼ばないで)

65 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 08:46
morpholinoについては
ttp://www.gene-tools.com/
を見るべし。
んで、実際に使った人はいるの?


66 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 12:34
マウスの腫瘍ってけっこう量要るよね。
お金持ち


67 :いまさらだけど:02/02/11 02:56
>51
アメリカでの業者名と値段を教えていただけませんか?
いくつか見つけたけど実績がある所に注文したいので。


68 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/23 23:11
PNASにヘアピン構造のRNAを発現させても抑制出来るって
論文出てた。これなら俺にもできる?


69 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/24 04:05
>68
そうみたいだね。でも遺伝子のどこを狙えばよいのかは
やってみないとわからんらしいね。さあオリゴをじゃん
じゃん発注じゃ!

70 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/24 10:47
ダーマコンって会社が専門にやってるってのを
同僚に教えてもらいました。(当方在外ポス毒っす)。
彼女は、ここで注文してから、oligofectamineを使って培養細胞に
入れてたけど、試した例では全部western blotで全然見えなくなってたです。
興味ある人はのぞいてみてはいかがですか。
http://www.dharmacon.com/index.html

んで質問なんですが、細胞は分裂増殖してる必要があるのでしょうか?
同僚の結果では、50%confluentの時にかけてからタンパクの量をwestern blotまたは
immunocytochemistryでアッセイしていたんですが、神経みたいなpost-mitoticなターゲットにも
効くのかどうか知りたいんです。

71 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/04 21:22
あげ

72 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/07 23:48
mammalianできくの?

73 :Sage:02/03/09 02:06
結局、内性のNAT(natural antisense transduction)って機能的役割をもってるの?
まだわかんないんだっけ?

74 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/13 01:47
一応リンク

神経系にRNAi機構は存在しないの?
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1015690094/l50
書き込み不要

75 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/13 04:57
siRNAのターゲットどこにしたらいいんでしょか?
mRNAの二次構造予測にかけてみたんですが、あまり関係なさそう・・・
どこをどう狙えばうまくいくのか?
初めはみんな開始コドンから50nt〜100ntって言ってたのに
最近の論文はみなこれ無視してるし.それでもうまくいってるし.

76 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/13 17:53
RNAiって酵母でもできるんですか?教えてください

77 :修士一年:02/03/13 20:14
癌細胞で、c-mycをRNAiで抑制できますか?

78 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 03:34
>>76
わたしはしらない。
でもcerevisiaeならノックアウトもらった方が速いんじゃないの。
ちがう?

79 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 10:08
>>59
HPLC精製でもカートリッジカラム精製でも
結果はほとんど変わらなかった。
安くて収量が多いほうがよければカートリッジカラムでいいし、
心配だったらHPLC精製にしたら。
>75
5種類の遺伝子について、
スタートから100塩基くらいのところで作ってみたけどすべてうまくいった。
>77
インターネットで検索かけてみたらどうでしょう。
見つけたけど教えない。

80 :79:02/03/14 10:16
ちなみにバイオサービスに注文した。
健闘を祈る。

81 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 17:58
morpholinoいくらなんでも値段が高すぎる。
独占禁止法違反!!
誰か安く合成してください。

82 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 08:59
ライセンスが絡んでいる。

83 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/16 03:28
>82 morpholinoの合成法にライセンスが絡んでるということ?
ライセンスが絡まないような合成法をどこかで開発してくれなきゃダメって事か。

84 :名無しゲノムのクローニング失敗さん:02/03/17 22:30
>70 なぜ分裂する細胞でないと効かないと考えたの?
現在のRNAiモデルからすると分裂中の細胞である必要はないと思うよ.
ただ神経系の細胞ではRNAiは効きにくいというのをよく聴くなぁ.
Dicerの発現が弱いとか、RNA editingに関する酵素が多く発現
してるから(dsRNA/siRNAが修飾されて塩基不対合を起こして二本鎖
としてRNAiに関わる酵素に認識されなくなってしまうのでは・・)
などなどいろんな説が出されてるみたいだけどね.

85 :RNAi-初心者:02/03/19 22:52
みなさん、詳しいですねぇ、、、。
あまりに初歩的な質問ですいません。
出来ましたらレスお願いします。
Dicerは dsRNA の切断後、23merRNAをくわえこんでいるのでしょうか?
また、植物とか下等生物で virus に対する防御で使われるって
どっかの review で読みましたが、外来・内在に関わらずヘアピンRNAはターゲットになりますか?


86 :名無しゲノムのクローニング失敗さん:02/03/22 01:09
>Dicerは dsRNA の切断後、23merRNAをくわえこんでいるのでしょうか?

nature Vol.409 295の話からすっと、Dicerは最終的にRNase(未同定)にsiRNAを渡すって
考えられるけど.ホントのとこはまだどーなってっかわかってねーんじゃない?
未だにどの酵素がmRNAを最終的に分断してるかは不明のはず.
核酸・タンパク質のコンプレックス(RISCとかsiRNPって名前つけられてるヤツ)
がその主役だって事はわかってんだけど、その構成因子がわかってねーんだよなぁ.

さらに俺が最近不思議に思ってんのはmRNAは、siRNAと対応するどの部分で
切断されてんだ?って事.あるペーパーではちょーどsiRNAの真ん中らへんで
切断されるって書かれてた.
が・・・
ドロソフィラやC.elegansのRNAiでは細胞内で生じたsiRNAをtemplateとして
RdRP(RNA dependent RNA pol)がさらにdsRNAをつくるって現在考えられてて
この新しいdsRNAをまたdicerが切断してさらにsiRNAを生み出すってモデルが提唱されてる.
transitive RNAiの説明にもなるって事で結構信用されてるモデルがあるんだけど、
このモデルによると切断されるのはmRNAのなかでもsiRNAに対応する
[両端]だよな.どーなってんだ・・・???

>外来・内在に関わらずヘアピンRNAはターゲットになりますか?
どーいう事??
ヘアピンRNAのdsRNA部分はRNAiを引き起こすトリガーになるか?って事?
それともヘアピンRNAをターゲットとしたRNAiは起こるのかって事?




87 :名無しゲノムのクローニング失敗さん:02/03/22 01:12
>70

ヒトdicer遺伝子に対するRT-PCRの結果では、脳のcrude homogenate
にはdicer遺伝子が検出できなかった・・・というような論文を見たぞ.
ただ、ヒトdicerの文献は、もともと別の遺伝子として命名されてるから注意.
あとでダイサーってわかったんだけど.

88 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/29 01:05
ambion から出てるRNAiのキットを使ったことある人!
使い心地はどうですか?


89 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/31 20:52
         ______
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 /   ー── (●_●)───   \
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 |   ∪    |-- ̄`´ ̄--|__    ∪ . |     / >>70,>>84
 |         |二二二二-|         |   <    細胞が分裂云々ってのは、
 \      丿      ヽ       /     \  トランスフェクション効率に関係していると思われ。
   \_     _- ̄ ̄ ̄-_     _/        \_________________
       ̄ ̄ ̄\__/ ̄ ̄ ̄

90 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/02 19:00
ambionのキットはいくらぐらいするんですかねー?
日本で扱っている会社ってありますか?

91 :どなたか教えて下さい。:02/04/02 23:53
mammalianの培養細胞にRNAiを行った場合、その効果は4日後が最大になるとのお話ですが、効果の持続の方はどうなんでしょうか

92 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/03 08:59
タンパク質のturn overによって違うと思うけど。
自分で確かめてみたら?

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