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▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼

1 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 13:28
いま実験でうまくいかないことスレッド パート2です。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。

皆様よろしく。

パート1 全部
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/967541407/

パート1 最新100
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/967541407/l100

2 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 14:13
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/967541407/975

クローニングなんて今日び楽しくないだろ、もともと。
さっさと遺伝子取って、それを使って生物学的な実験をすべし。
スブトラクションとかDDとか未だにやっているラボがあったとは、驚きだ。

3 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 14:16
学部学生に働かせて、よさげなのが出たらワシが実験する。
そんなもんです。

4 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 14:26
楽しくないのは学生にやらせる
これ王道
で、結果が出たら「指導」と称して
自分の思う通りにディスカッションを運ばせる。
論文が出れば
「先生は情熱を持って地道にサイエンスやってるんですね」
と好評、
政治力の糧となる

5 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 14:29
>>3
>>4
まあ、そんなもんです。
はやく職取れよ。

6 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 16:49
>2
うちですが、私今してますが何か?

7 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 17:14
>6
かわいそうに

8 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 18:07
たしかに、マイクロアレーが登場してからdifferential screening
の方法が変わってしまいました。Affymetrixぐらいゲノムをカバー
してるチップがあれば、例えばクロマチンレベルで差異のある部位を
プローブにしてcDNAを釣るのも可能になるでしょう。
実際こんなことしてる人いますか?(当方これでグラント申請予定)

9 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 19:47
まあマイクロアレーもDDもsubtractionも
通の俺から言わせればカスだね。
通はやっぱりmap-based cloningこれだね。
しかも自分でYACコンティグ、BACコンティグ、lamdaコンティグを
しこしこ作る。
これ最高

10 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 19:48
しかしYACがつながらないこともある、両刃の剣。
まあ素人にはお勧めしない。

11 :6:01/12/26 21:31
>9
マクロアレイって相同性のある配列を釣るシステムですよね?
漏れのは相同性があるっていう配列がまだ未知なんすよ

12 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 21:45
in situ hybridizationをやっているんだけど、核が染まっちゃう。
パラフィンブロックだから内在性のAPは失活してるはずなんだけど。
プローブ以外の原因って、何か考えられるかな。

13 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 22:12
>>11
ハァ?なにいってんの?君
>>12
良くあること.
DIGだろ?

14 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 22:19
>>12
どうやってやってるかくらい書いてね.

15 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/26 22:21
>>12
核だけですか?でないとすれば・・・
エクソンのプローブを使っているのでしたら、pre-mRNAでは
ないでしょうか。当方も、turnoverの早い遺伝子では見たこと
ありますよ。その場合、核に全般的に染まるのではなくて、
なぜかドット状に染まりました。同じ遺伝子の違う部位に
プローブを設定しても同じで、センスプローブでシグナル
なしならますます可能性高し。

16 :ともちん:01/12/26 23:54
インバーティッドリピートのクローニングがどうしてもうまくいきません。アドバイスをお願いします。

17 :うるとらあんそらっくす:01/12/27 02:10
>15
ドットはひよっとして2個見えない?ハエの卵の場合だけどうまく
染まると二つの染色体から転写されているゲノム領域が2個ドット
状に見えるよ。該当遺伝子座を欠失したdeletion 染色体とのヘテロ
接合体の細胞ではドットは1個しか見えない。他の生物でもそうい
うことは見られるのかなあ。

18 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 02:48
>>16
hostは?SUREとかにしたらよいかも。

19 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 05:14
>>17
その通り!
RNA-FISHなみの解像度だと当たり前の話らしいです。
細胞が十分に大きいと、DIGのISHでも見えます。
(小生はマウスの脳の話です)

20 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 19:25
>>15
>>17
>>19へ。

>>12
が対面している困難は、
そんな高度な問題ではないと思われる。
DIGでやると、たまーに核がびた〜っと染まっちゃう事があるらしい。
たぶん、specificな発現ではない。
おれは一回しかそうなったことがないので、原因は不明。
多分、プローブ入れすぎなだけだとおもう。

21 :15=19:01/12/27 19:30
「多分そうかな」と思いながらついカキコしました。
漏れの経験上、DIGのバックは主に最後の免疫組織の
部分によることがおおいので、十分ブロッキングした
方がいいと思いますよ。

22 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 19:41
>>16
GibcoのSTBL2でうまくいきました。値段分の仕事してくれるよ。

23 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/27 19:44
モー娘。のお宝画像がいっぱい!!
遊びに来てね♪
http://muvc.net/taron/index.html

24 :12です:01/12/27 22:04
お返事ありがとうございます
>>15
>>19さんへ
両方ともあります。ぽちっとドットが2つある場合は、
たしかにキレイです。
ドットがたくさん出るものは、そういった理由の割には
出現率が多すぎる気がします。

>>20さんへ
こんな私でも濃度は変えてみたんです。
私のつまらない困難は来年にもちこしでーす。

25 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 00:20
12さん。
あと考えられるのは、核小体。
問題なければ、遺伝子の名前もカキコしてくれ。

26 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 02:00
Proteomicsをやろうと思うのですが、核蛋白のみを2Dゲルで
流してるのですが、泳動パターンが安定しません。
どなたか、いいプロトコールもってませんか?

27 :Voet:01/12/28 14:11
ISHで核が染まる時はプローブ中に反復配列の存在を疑うべし。
BLASTして怪しいところを削ってプローブ作り直す。
後はWashの温度を振ってみるのもよろしい。

28 :ともちん:01/12/28 16:02
18さん、22さんありがとうございます。いまはホストはXL-1blueです。研究室にsureがあるのでとりあえずそっちで試してみようと思います。GibcoのSTBL2って高いんですか、だめだったらやってみます。
また、インバーティッドリピートの シークエンスは無理なのでしょうか?

29 :ZONE:01/12/28 17:12
顕微鏡でプランクトンやバクテリア、細胞などをカウントする
時に、デジタルカメラで画面を撮影したいんですけど、専用の
顕微鏡(例えばUSB接続)じゃなきゃできないんですか?
顕微鏡の上に普通のカメラがついているやつがあるんですけど
そのカメラをデジタルカメラに代えてとかできませんかね。
試しもしないでなんなんですけど、やっていらっしゃる方いま
せんか?

30 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 18:48
>>29
できます。
ニコンのクールピクス995にアダプタつけてやってます。それ用のリレーレン
ズというのがオプションで売られてます。ときどき写真撮る程度ならそれで十
分だけど、たくさんやるならコンピュータまで含んだシステムの方がいろいろ
便利でいいと思います。

31 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 18:50
>>12
パラフィン包埋の段階では内在のAPはけっこう生きてます。

32 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 22:17
>29
うちも光学顕微鏡にデジカメ付けて撮影しています
「オリンパス実体顕微鏡」というスレにいろいろ書いてあると思います
リンクはり方知らんのでスマソ

33 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 22:24
>>12
>パラフィンブロックだから内在性のAPは失活してるはずなんだけど。

オイオイいったい誰にそんなウソ習ったんだYO?

34 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 23:10
>>32
これですね。
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/993705393/l50

35 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/29 14:57
>34
フォローありがとです。
エクスプローラとかでスレッド一覧ですれ選んで
そのアドレスを貼ったらいいのでしょうか。
かちゅだと最後の/150が表示されてなかったもので。

36 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/30 04:39
/150はなくてもいいと思います。

37 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/03 21:36
プロ手ねーすで死ぬんでしょ?
AP

38 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/04 02:47
>>37
死ぬね。少なくとも俺のサンプルでは死んだ。

39 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/06 22:30
ge

40 : :02/01/08 19:10
基本的な質問ですけど、ウェスタンのメンブレン何使ってます?
私はニトロセルロース一筋なんですけど、PVDF使ったら見えないバンドが
見えたりするものなのでしょうか?
また、バックグラウンドは高くなりますか?
抗体の抗体価が低くてシグナルが弱いもので、PVDF使ったらどうかと思っているんです。

41 :zone:02/01/09 00:04
>30.32.34
情報ありがとうございます。
さっそく試してみます。

42 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/11 08:51
蛋白の発現とmRNAの発現が違う。
mRNAはすべてに発現してるが蛋白は発現しないところがある。

43 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/12 02:09
>>42
何が言いたいんだ?
どっかの質問に対するレス?
それともアナタが質問したいの?

44 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/12 02:53
>>43
NorthernとWesternの結果が一致しないと言いたいのでは?

45 :43:02/01/12 04:59
ふーん。そういうことなら。
>>42
mRNAは常に一定でもタンパク量が変化するモノはたくさんあるじゃない。
なんかの条件で分解速度が変わってるんじゃないかな。
とりあえずcell cycleをregulateするタンパクについてお勉強するとよろし。

46 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/16 03:39
今指導してる学生が「統計を教えろ」と来た。
いままでなるべく統計を避けてきたが、年貢の
納め時か?
彼女はReal-time PCRのデータの有効性を
言いたいらしいが、変化が最高で4倍くらいで
わし自身それにどれだけの意味があるかわからん。
しかし、取り敢えず学位だけは取らしてやらんとな・・・
うちのコンピュータにPrism3なるソフトがはいっとるが、
それが解れば解決するような問題でしょうか?
なるべく横着する術をご教授願いたい!

47 :IL4:02/01/16 03:42
HIVで一儲け?

48 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/16 11:42
そもそも統計そのものには意味は無いよーん。
平均値に差があるかどうかを判定できるだけで、4倍の変化が生物学的に
意味を持つかは別の問題。我々が使う統計なんてその程度の物。
差があるかどうかは統計で判定できても、その差に意味があるかどうかは
統計では判らないんだから、>46の学生の場合、統計以前の問題のような・・・

49 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/16 12:46
統計自体は、理屈が解らなくても医学生物学用の参考書というか
例題集から同じパターンの探してあてはめれば、大抵の場合
用足りると思う。
「絵苦セルで学ぶ統計」とかそんな名前じゃ中田かな。

問題は48の言うとおり、統計以前のところにあるね。

50 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/16 13:59
質問版に書き込んだのですが
実験関係はこちらの版の方がよいということなので
書き込ませていただきます。
ALFシークエンサーを使っていて
いつもゲルの状態があまり良くない(プレランしたあとの波形がひどい)
のですがこれを改善するにはどうしたらよいでしょうか?

51 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/16 16:11
>>46
その「4倍」とやらが別の方法で試験したときにどうなるかを見ればいいんじゃないでしょうか。
あるいは「4倍」がテンプレート量をどのくらい振ったときに現れるかを
調べてみればいいかと。むしろ定量PCRにおいて検量線引かないのは危険過ぎます。

たとえばRT-PCRでサイクルやテンプレート量を振って半定量をしているペーパーがありますけど、
テンプレートを3倍量振れば電気泳動したときに目で見て分かります。
その差は3サイクルくらい余計に回すとだいたい揃います。(乱暴な言い方だけど)

そのくらいの差でも、「違う」ということでペーパーが通っているので
本当に4倍違うなら通常のPCRでも条件が合えばバンド強度の差が出るはずです。

うちはリアルタイムやれるほどカネが回ってこないためセコセコとcompetitorを作って
やってますので、Prismについてはお金持ちな方々に…(わら

52 :51:02/01/16 16:15
あ、なんか的はずれなカキコだったのかも…

53 :46:02/01/16 16:47
みなさん、アドバイスありがと。
実はわしもまったく同感。リアルタイムなんてやる必要なし。
思うに彼女は「単にやってみたかった」だけだと思われる。
しかし、あがって来たデータが全く乏しい。唯一使えそう
なのがこの「4倍」ってやつです。彼女の本当の指導教官
(グループリーダー)も、「好きにやっていいよ」と言った
手前、後に引けないのでワシに押しつけてきた。
「絵苦セルで学ぶ統計」はためしてみよう!

54 :zone:02/01/16 22:25
3Hチミヂンをつかって、細胞の増殖を定量する際に、
新しく合成されたDNAの量や細胞数ってどうやって知る
のでしょうか。
エタ沈などで普通にDNAを精製しても、できるのは全DNA
ですよね。その内どれくらいが単位時間当たりに増えた
DNAなんだか。
検量線の書き方とか書くのでしょうか?

55 : :02/01/16 23:56
>>46
スタンダードテンプレート作ってreal-timeRTで4倍差があるなら結構差があるのでは?
統計学的にt検定でもしたいってことですか?
まー、サンプルが一個ってことじゃないですよね。よくわからん。

56 : :02/01/16 23:58
オリゴつかったアンチセンス(培養細胞)がうまくいきません。
オリゴか悪いのか、プロトコールの条件設定が悪いのかもわかんないよー。

57 :sage:02/01/17 09:17
>54
タイムコース取りなさい。
合成鎖に取り込まれなかった3Hは、
DNAの抽出・精製の際に洗い流されるから。
あまりに初歩的なことなのでsage

58 :57:02/01/17 09:18
下がってなかった・・・。
スマソ・・・。

59 :zone:02/01/17 10:32
>>57.58
タイムコース作る際に、その都度抽出されるDNAの
回収率って同じなんですかね?
もしそうなら良いのですが、バラつくのであれば
無駄じゃないですか?


60 :57:02/01/17 10:46
>59
それはあなたのレベル次第。学部生ですか?
同じ培養液から径時的に細胞を分注し、それからDNA抽出しても大きなばらつきはなかったよ。
というか、大きくばらつくのなら抽出法をちゃんとマスターしなさい。

61 :57:02/01/17 10:57
>59
質問板でも質問をみたんで付けたし。
仮に3H取り込み量と細胞増加数のスタンダードがあったとする。
それを参考に得られた3Hから増加した細胞数を算出したとしますね。
その際に、あなたのDNA抽出・精製の精度が悪かったら当てにならないでしょう?
目的は細胞増加数を算出したいの?

62 :sage:02/01/17 12:07
>56
あまりにも漠然とした質問だぞ。
これで答えてくれというのは無茶だ。


63 :名前にsageと書いたアホ:02/01/17 12:11
58ではないが下がってなかった・・・
スマソ・・・。
何故かE-mail欄が表示されていなかったのじゃ。


64 :56:02/01/17 18:05
すんません。
オリゴの設計がまずかったみたい。
mRNAの2次構造調べたらちょうどヘアピンのくっつくところにかかってた。
やり直します。

65 :俺も仲間に入れてくれ:02/01/17 22:17
市販のDNA精製キットの回収率ってどのくらいなん?
俺も似たようなことやってるけど、精度はまあ良し
としよう。
で、もし回収されているDNA量が100パーセントじゃ
なかったら細胞一個当たりのDNAとかもとめるの
無理じゃない?

66 :ここだけ10年遅れたポス毒:02/01/17 22:50
CsCl超遠心でやってます。2回まわしてます。キットってなんですか?

67 :65:02/01/17 23:00
>>66
Promega の Wizard DNA purification kit 使ってます。

68 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/18 01:31
PharmaciaのECLウエスタンバンドがでないよう。
前回生まれて初めてやってうまくいったのにい。
trasferする前のゲルにはバンドあるしポンソーでもバンド見えるのにい。
抗体のincubationってやっぱり一時間もやらないとだめなのですか?
前1/5000でできたから今回1/1000にして30分にしたんだけどだめ?
濃くしたらどんどん時間短くできるって思ったけど、、、

69 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/18 02:23
>濃くしたらどんどん時間短くできるって思ったけど、、、

そんなことはありません。

以上。





70 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/18 17:36
>>54
よく知らないんだけど、トリチウムチミジン取り込みって細胞をフィルターに引っかけて
液シンでカウントするんじゃないの?
DNAを抽出する理由がわからないです。エタ沈してまで精製する理由が。

細胞数を知りたいならトリプシンEDTA回収してカウントした方が
まだ信頼性があると思いますし。

71 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/18 18:39
トリチウムチミジン取り込み量が液しんから求まって、結局その値が
何を意味してるのかという問題だ。
増殖を定量するのであれば、細胞カウントするだけじゃだめなの?

72 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/19 07:33
>>66
そのレスのみでうちで雇ってあげます。
キット使う奴は嫌いだ。(それでもキアゲンの
カタログはもってまっせ!)

73 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/21 10:45
>>66
うちもキット買えるほど裕福じゃなし。
下手に慣れないキットを使うよりか超遠心した方が安心。

74 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/21 14:02
>>54
頭悪いぞ!
ホットを入れてから新規に合成された核酸量が測れるんだから
それで増殖の検定が出来るだろ。

75 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 07:34
>>73
キットはバカでもできるようにしたものです。


76 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 09:32
>>75
だからキットを使わなきゃ何も実験できないヴァカが増えてるのだな。
基本的な手法も実験原理もロクに知らない学部生にまでキットを使わせるのはちと問題だと思う今日この頃…。

77 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 09:38
>>75
でもそんな技術と科学の本質には全く相関はない。
それはただの精神至上主義です。
効率よくて何かわるいですか?

78 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 18:08
RNA取るのにグアニジンとかゴチャゴチャ量って混ぜるのももう嫌だしなぁ。
キットの方が収率いいしサンプル切片が小さければ四の五の逝ってる場合じゃないし。

79 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/22 21:50
ウェスタンやるときのトランスファーって定電圧と定電流どっちが
均一に転写できますか?

80 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/24 03:04
定電流。

81 :75:02/01/24 07:00
>>77
悪いとは一言もいってないよ。俺も売ってるのはだいたい使っている。
ただ、76が言うことももっともだと思う。特に原理を理解しないで使うって
ところ。キット使っていても、できない・うまくいかないときがある。
その原因究明解決ができるかできないかにつながる。
教えるときに原理もしっかり教えておけばいいんだけど・・・

82 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/24 11:27
>>77
効率があがるのは確かにいい事だと思う。
しかし、>>81が言ってるように、行き詰まったときに
回避できるか否かは原理を知ってた方が有利と思う。

それと、現時点でキットを使う余裕のあるラボなら良いが、
将来的に他所に行く、独立するって時に必ずしも予算が十分にある訳じゃない。
それは予算を引っ張る努力が足らんのだって言われればおしまいだけど。
その時にどうやって手近なもので代用するかってのもその人の能力だろう。
その為にも基本的な原理・手法は知っておいて損は無いだろうと思うけどね。

少しスレ違い・レス違いになったのでさげておきます。

83 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 17:10
ドットブロットについてお訊きしたいのですが。
精製した核酸を0.2マイクロのニトロセルロースメンブレンに、ブロッター
を使ってブロットするように習いましたが、核酸って、0.2マイクロメートル
の穴は通過しないんですか?
そんなに核酸って大きいのですか?


84 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 17:18
ボスとの関係がうまくいっていません。
どうしたらいいですか?

85 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 17:23
>>79
きちんとメンブレンの面積を測ってそれにあわせて定電流でやるのがよい。

86 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/27 22:56
トランスジーンで特定の神経細胞を殺すのには、どんな遺伝子がいいの?

87 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/28 02:25
>84 研究室移動

88 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/28 02:39
特異的プロモータの下になんかつけるとか。>>86

89 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/28 03:47
>>86
全く意味がわからんな。
ジフテリアトキシンとかを聞きたいのかな?

90 :100:02/01/28 03:53
>>83
直径は2nmだが長さを考えろ。
電気泳動やるアガロースだってスカスカの網だ。

91 :83:02/01/28 07:56
>>90
DNAは長いから、フィルターに絡まるってことですか?

92 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/28 11:41
>>83
どっと部ロットなら、詳しい事はしらないが、
プライマーは抜けちゃうよ。
だから、100bp以上は無いとダメ。

93 :う〜ん:02/01/28 12:37
Sf9Cellを使っていますが、トランスフェクションうまくいかないよ〜

94 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/28 18:56
>>93
リポフェクションあきらめて今日からカルシウム沈殿でやってます。

95 :う〜ん :02/01/28 22:28
カルシウム沈殿でってなんです?
2ヶ月前にはじめたばかりなもので、、、m(_ _)m

96 :名無しゲノムのクローンさん :02/01/29 05:45
>>93
手順に問題あり

97 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/29 11:33
遺伝子組換体がえられない…。
ちきしょ〜! 青い○○○○なんてきらいだ!

98 :う〜ん:02/01/29 12:17
96さんへ
テジュンですか?線状DNAとリポフェクチン、私のDNAをボルテックスして、
Seed60に播いておいたSf9Cell上に滴下するだけですが、、、
もちろん、SF9Cellは、10の7乗cell/ml(3日で3倍に増えたやつ)をSeedデッシュ
にまいて1時間、R.T.で清地し、Mideumで洗ってから使っているし。。。
むむむぅ〜

99 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 00:00
>>98
以下、素朴な疑問です。

1.直接リポフェクチンにDNA混ぜてるのでしょうか?
2.線状DNAってキャリアでしょうか?入れる必要があるとは思わないんだけど?

たいていDNA 量に対して最低限必要なリポフェクション試薬量があるから、
キャリアなんぞ入れてしまうと、まったく入らなくなると思われ。

たとえば、ある試薬で1μgのDNAに対して最低1μlの試薬が必要とか。

説明書にしたがってやれば、入りそうなもんだけど...読み返してみてはどうでしょう。
何か重要なステップを忘れてませんか?


100 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 01:50
>>97
耐えろ。
ひたすら突け、あをいころにーを。

ころにーに関する熱い思いはシャア板でどうぞ。

101 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 01:52
ふっシャアネタが100とはな。

102 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 04:34
>>98
りぽふぇくちんー>セルフぇ朽ちん
voltex ->ぴぺてぃんぐ(bac midがきれるから)
medium -> serum /抗生剤 free
以上、プロとコールでもっとも注意されている点。

103 :96:02/01/30 05:03
>>102
抗生剤もなしにしなければいけなかった?俺は入れていないけど。

>>98
cellも7-10日でコンフルエントになるくらいの数にする。
トランスファーベクターも入れていますよね。当たり前か・・・
コントロールをつける。全てのトランスフェクションができないのなら
完全に手法が悪い。その遺伝子だけなら発現する遺伝子が悪い可能性あり


104 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 06:59
>>sf9
どういう方式があるのか良く知らないんだけど、うちではInvitrogen(旧Gibco BRL)のBac-to-Bac Systemでやってます。
・バクミドは調整時も含めてボルテックス厳禁。
・キャリアーは入れていません
そんなもんですかな。激しくガイシュツですが参考までに。

105 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 08:09
PCRでDIGプローブ作りやってるんですけど、
バンドになりません。
アニーリングの温度を通常より5〜7℃下げるだけでいいんですよね?

106 :う〜ん:02/01/30 11:08
102,103,104さん、
ありがとうございます。
キャリアー(線状DNA)を入れたのがわるいのかもしれません。Invitrogenのプロトコル
(冊子になっているヤツ)を読むと入れろと書いてあったので入れてみました。
おっし、もう一度やってみよう。
P.S.
103さん
Cellは、4日くらいでコンフルエントになるようにまいています。10の7乗cell/ml
をSeedに1時間整地です。
104さん
バクミドってなんですか?


107 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 16:19
ある分子の神経細胞での局在を制御するアミノ酸配列を調べる実験を始めました。

初代培養の神経細胞に目的遺伝子にeGFPをつないだキメラ遺伝子を導入し観察することを考えています。導入の効率は低くてもかまいません。
ウイルスを用いる以外に、遺伝子導入のいい方法はありませんか??

108 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 16:38
マイクロインジェクション

109 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 16:43
神経細胞は一般的に効率がかなり悪いです。
一部の人たちはリン酸カルシウム法を好んで使っているようです。
またマイクロインジェクションの場合、離婚美男とタンパクを
先に作ってから打ち込む方が良いとされています。

110 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 16:52
N本ラボ@慶應医薬理では、CNS,EMBO論文にやたらマイクロインジェクションの実験が多い

うまくいくんか?

111 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 20:03
ニトロセルロースメンブレンの上にブロットした核酸に
抗体をくっつける前の変性処理に、電子レンジを使い
たいのですけど、やっている方いらっしゃいませんか?

112 :102:02/01/31 08:04
>>106
キャリアーってなんのこと?
淫靡のだったら線状ウイルスDNAと組換えトランスファーベクターを入れなきゃ。
ウイルスDNAの切れているところにトランスファーベクターの外来遺伝子が入って
環状のウイルスDNAになるの。


113 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/31 10:37
>110
N本ラボ@慶應医薬理の論文はヤヴァいのが多くないか?

114 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/31 17:50
ウェスタンのサンプル調製
sample buffer入れてソニケーション
NP-40 lysis buffer
SDS lysis buffer
の使い分けってあるのでしょうか。

115 :99:02/02/01 00:58
>>112
あ、そうか。Bac-toBacしか使ったことないんで勘違いしてました。
(まさか、ほんとにSalmon Sperm ぢゃないだろうな...)

とすると、やっぱりDNAとリポフェクション試薬の混合あたりに問題がありそうですね。
あるいは、sf9が継代のしすぎでへばってるとか?
「結構感受性変わりやすい」って注意されたけど。

116 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/01 03:21
>>105
おいらはいつもかなーり凄いスメアになるけど、ちゃんとin situで染めるととてもきれいに染まるよ。
もちろん、同じようにスメアになったコントロールのセンスプローブでは殆ど染色が見られなかった。
アニーリングは大体45℃でやっていたように思う。
あと、テンプレートはPCR産物でやった。
とりあえず染めてみたら?

117 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 02:51
前スレで2種類の酵素で切る時それぞれのサイトがどのくらい離れてる必要があ
るかの議論があったと思うんですが結論を覚えてる方いらっしゃいませんか?

118 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 05:08
>>117
一番切れない制限酵素スレでいま似たような話題になっているぞ
一言で言えば酵素によって違う
NEBのページにある情報によれば2-3塩基離れていれば大抵切れるみたいだけど


119 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 05:22
>>117
がいじゅつですがNEBのカタログに、いくつかの酵素については書いてあるから
参考にされるといいですよ。

120 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 06:03
ここだねい。ほれっ。
「**一番切れない制限酵素**」
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1003080216/
103以降のレスを見よ。

121 :120:02/02/03 06:17
>117
前スレのdatファイルが手許にあるからざっと見てみたけど、やっぱり118,119の言うように、
NEB(New England Biolab)のカタログを見ろ、って結論だね。

しかし、このスレの前スレはむちゃくちゃ役に立つなあ。
今dat落ちしちゃってるけど、すぐ見ることもできるよ↓。
http://www.chikara.biz/multi/http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/967541407/

122 :はあー:02/02/03 17:56
分子量が5,000−6,000くらいのペプチドってpH5くらいだと溶けないの?
30%酢酸とかだと溶けるのは知ってるけど。。。
酵素と反応させたいんだけどどうしたらいいか
誰か教えてもらえませんか?

123 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 18:32
ガイシュツだったらすみませんが、どなたかAffi-gel Hzを使って
抗体をカップリングさせたresin を作成した方いらっしゃいます?
抗体カラムを使って抗原を大量精製するのに使ってみようと思うのですが。
これまでにCNBr-sepharose で同様の物を作って試したのですがアフィニティー
が極端に落ちてしまったみたいなんです。このAffi-gel Hz は抗原認識部位が
カップルされないようになっているらしいですが、
(1)resin だけ買って調製ようの試薬は自作した方がいいのか、
   或いはキットで買った方が簡単なのか?
(2)resin 1ml あたり最大でどのくらいの抗体をカップルさせる事が
   可能なのか?また、用いる抗体はmonoclonal IgG1 なのですが
   カップルすることはできるのか?
どなたか教えて下さい。お願いします。

124 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 01:23
ドットブロッター使ってブロットする時、使わない
穴ってどうやってふさいでますか?

125 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 03:07
>124
サランラップかパラフィルム。
これ最強


126 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 03:44
Sypro rubyを使ってタンパクを染色しようと思っていますが、研究室に
レーザースキャナーがありません。
今は核酸用のトランスイルミネーターとビデオプリンターでロール紙に出力しています。
パターンを簡単に確認するだけならこれでもいいんですけど、そろそろ論文用にデータを
残したいと思っています。
ビデオプリンターで出力したものをスキャナーで取り込んでもいいんですけど、
それだと画像があまりきれいではないのです。
(最初に出力されるビデオプリンターの紙が小さいので。)
CBBや銀染の時は直接スキャナーで取り込んでました。
だれか良いアイディア、Tipsを持っている方いましたらアドバイスをお願いします。

127 :& ◆h1MElHro :02/02/04 06:39
>123
(1)キットをそのまま使ったことがあります。問題無かったので予算に余裕があるならキットをつかってみては。
(2)Resin1ml当たり1mgぐらいのモノクロ抗体をカップリングに使用しました。
但し最初に抗体サンプルのバッファー交換(カップリングバッファーに)が必要でこの段階でサンプル濃度が薄く
なってしまうことを考慮して濃度が2mg/mlぐらいの抗体サンプルを使ってました。
あとカップリングは抗体の糖鎖を介しておこなわれるはずなのでどの種類の抗体でも問題無かったように思います。
マニュアルを見て確認してください。


128 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 06:58
>>118-121
ありがとうございます。カタログ見てきます。
NEBのカタログすごく役に立ちますね。
これだけ使ったら何か注文しないといけないような。

129 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 13:23
>>114
どこまで細胞をぶっ壊すかという話。

130 :123:02/02/04 13:41
>127
どうもありがとうございます。キットを試してみます。

131 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 10:14
オイルフリーのPCRって、時々蒸発している気がする、、、
チューブの締りが悪いのだろうか、、、

132 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 13:47
>>131
tubeのメーカーをいろいろ試してみるといいよ
うちの部屋は主に8連を使っているけど
以前使っていたメーカーのだと時々蒸発していたが今使ってるのは大丈夫。
キャップをつけるときの感触からして違う。

133 :131:02/02/06 15:02
>132
どうもありがとうございます
ちなみにどこのメーカーでしょうか?
8連じゃないやつも教えてください
おねがいします

134 :132:02/02/06 20:22
>>133
ABgeneのを使ってるよ。8連ではない普通のtubeもそれ。
ソレンソンのもなかなか良かったよ

135 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/06 23:54
>134
どうもありがとうございます
カタログで探しでみます

136 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 17:40
ミニプレしてプラスミドを取りました。
エタ沈したら大きなペレットができて、260nmの吸光度もちゃんとあるのに、
制限酵素で切って泳動したら何も見えません。一体何が取れたのでしょうか?

同時に処理した別のサンプルは同じようなペレットが出て、吸光度は同じかよ
り少ないくらいですが予定通りのバンドになって見えます。

137 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 17:52
>>136
1.制限酵素で切る前のサンプルを流してみましょう。
2.もう一度吸光度を測りましょう。吸光度260nm/280nmの比は?
3.何に溶かしましたか?溶かした時は他のサンプルより溶けにくかったですか?
4.制限酵素は何ですか?切り過ぎたわけではありませんか?
5.ゲルの染色はどの様に行っていますか?


138 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 17:54
ペレットはRNAじゃないかな?
RNAを除くための操作(ペグ沈)などやっていますか?
プラスミドがなくなってしまった原因として考えられるのは、
抗生物質を大腸菌培養中にいれておかなかったため、
プラスミド含有菌が極端に減ってしまったことが考えられますが、
普通に気を使ってやり直すことでちゃんと取れると思います。

139 :136:02/02/07 18:23
>>137
酵素処理前のサンプルでも何も見えません、と思ったら10kより上にうすーい
バンドが出てるのが見えました。
260nm/280nmの比は1.8くらいで、220nmから320nmまでスキャンしても
普通のカーブが出ます。ちゃんとバンドが出るサンプルと同じです。
溶媒はMilliQ水、酵素はEcoRIとApaIです。染色は泳動後にEtBr溶液に15分
つけました。

>>138
RNAについてはKOAc溶液を加えて遠心したあとでRNaseを加えて37℃で30分
処理しました。培養時には抗生物質(カナマイシン)を加えました。濃度は
50ug/mlです。

一つ気づいたのはベクターの説明書に一本鎖DNAが必要な時はXL1-blueや
JM109をつかえと書いてあって、使ったコンピがXL1-blue MRF'なことです。
これは何か関係あるのでしょうか?

140 :137:02/02/07 18:59
>>137
>酵素処理前のサンプルでも何も見えません、と思ったら10kより上にうすーい
>バンドが出てるのが見えました。

取れたのは大腸菌ゲノム。プラスミドが入っていない=>138の言うように抗生物質が入って無い。やり直して下さい。

他のサンプルには同じバンドはありませんか?
あったなら、実験手技にも少々改善の余地有りですね。
キットを使ってますか?自作の試薬を使ったアルカリ法ですか?

141 :137:02/02/07 19:12
間違えた自分宛だ。
>>139が正しい。で、ついで。
大腸菌のゲノムが混入するのは、solution2.のNaOHがへたっているか、
solution2,3をいれたあと激しく撹拌し過ぎている、のどちらかだとおもう。



142 :136:02/02/07 19:23
>>140
いろいろありがとうございます。
ちゃんと取れた方のサンプルではこのバンドは出ていません。
アンピシリン耐性のプラスミドは取れてカナマイシン耐性の物が取れてないの
ですが、カナマイシンは調製しなおした方がいいでしょうか?
コロニーを拾ったプレートでは選択が効いているように見えるのですが。

ミニプレは自作の試薬でやっています。

143 :136:02/02/07 19:26
>>141
そういえば今回Sol.3を入れた時の沈殿が多くて混ざりにくかったので転倒撹拌
の回数がふだんより多かったです。NaOHもちょっと古いので作り直します。

144 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/07 22:11
たくさんのcDNAをRT-PCRでクローニングしてるんですが、どうしても、ミューテーションがたくさん入ってしまいます。
どなたか、良い、proof-readingの熱耐性ポリメラーゼをご存じですか?

145 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 00:11
>>136
カナマイシンはあんまりへたってるって話は聞かないけれども、
抗生物質がへたってるって可能性はある。
特にテトラサイクリンなんかは光で分解するから
へたり易い。

もう一度やってみそ。

146 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 00:45
>>122
アミノ酸組成、アミノ酸配列によると思うけど
pH変えるとか、DMSO、DMFに溶かすとか

147 :M2 ◆8fbZZkx. :02/02/08 02:10
>>136
カナマイシンはオートクレーブしても大丈夫。
ヘタることはそうそうないと思われ。
コンピを自作しているのならばカナマイ耐性の菌がコンタミしていることも考えられます。
プレートもチェックしましたか?
それと、ミリQに溶かすのって大丈夫なんですか?
私はTE or 滅菌水に溶かしています。

148 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 02:14
どっかでBL21(DE3)がkan plateでバリバリ生えたとかみたような。
うーんどこだっけ。

149 :136:02/02/08 03:40
ストリークしておいたプレートからコロニーを拾って、培養をはじめました。
どうなるのかは明日のお楽しみです。

150 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 04:55
RNaseいれても、除く操作をしない限り260nmの吸収は見えてしまうような
気がしている私はDQNでしょうか。
私はLiCl沈してますが。

151 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 19:23
>144
サイズは?

152 :144:02/02/08 21:21
>151
2kbから、3kbの間のもの数個です。

153 :136:02/02/09 00:30
>>147さんが正解のようです。
コンピの菌株がいつのまにかKan耐性のXL10-Goldに変わってます。
他人の作ったものをよく見ないで使った私がバカでした。
皆さんありがとうございました。

154 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 05:26
>123
protein-GかAに結合させて、DMPでカップリングした方がきれいでかつ、
早そう。とうぜんprotein-A or Gたから抗体を阻害しないし。
高価なのがもんだいなのか?


155 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 13:46
>>150

よっぽどきれいに精製しない限り、吸光度=プラスミド収量にはならない。
ミニプレップごときには電気泳動でコントロールDNAと比較した方が正確。

156 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/12 14:21
>>144
長いな。制限酵素で切って変異の入って無いものをつなげるわけにはいかんか?
今、使っている酵素は?TAクローニングはしているの?


157 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/20 14:35
age.

158 :謝辞:02/02/22 03:05
修士課程における研究を進めるにあたり、貴重なご意見をいただいた2ちゃんねらーのみなさんに厚く御礼申し上げます(藁

159 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/22 03:18
>158 修了おめでとう

は〜 発現しない予定の実験で発現しちゃったよ。。 もらったBL21が実はDE3ではなかったという
俺仮説が…… やっぱ配列が悪いのか…… あう〜ん

160 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/24 00:44
QIAEXIIのシリカは再利用可能でしょうか?可能とすればどうやって保存すればいいでしょうか

161 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/24 11:03
植物系の方に初歩的な質問です。
オーキシン(IAA)による遺伝子発現の誘導パターンを見たいと思っています。
いくつか論文を見たら1u(マイクロ)Mから50uMで使ってるみたいんなん
ですが、一般的にはどの位の濃度が適当なんでしょうか?

あ、材料はシロイヌナズナの芽生えを使って、
処理はIAAを含むMS培地か水に浸すことでやろうかと考えています。

それから、オーキシンってあまり高濃度だと阻害効果がでてしまいますよね?
その境界の濃度ってどれくらいなんでしょうか?

162 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/25 17:52
ブルースクリプトに15Kbくらいのインサート入れられるでしょうか?

163 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 00:01
>>159
BL21(DE3)でもものによってはプロモーターのリークあり。

>>150
RNaseAを普通の濃度で使っている限りは、分解産物だってエタ沈される。
よってその点じゃあ、あんたは正しい。が、LiCl沈殿は高分子のRNAは除けても分解産物は除けない。

164 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 00:13
KOD plusで増幅した産物(1.5kb)をクローニングしようとしているのですけど、まったく入りません。

165 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 02:51
>>164
そんなんもっと詳しく書かんと答えられんよ。
人にモノ聞く時はもうちっと考えな。
有力と考えられる理由を2つあげといてやる。
俺はやさしいからな(藁
・KODじゃTAクローニングはできんよ。
・制限酵素サイトの「足場」が足りんのでは?NEBのカタログのAppendixにて確認されたし。

166 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 03:17
>>164
クローニングの方法は?
KOD plusは平滑末端クローニング(KOD DASHはTAクローニングできる)。
ベクター側を脱リン酸化してるなら、PCR産物のリン酸化or5'リン酸基のついたプライマーを使用。

それでも入らないなら、一度、ベクターとインサートをモル比でふってみては?
ベクター:インサート=1:1,1:2,1:5,1:10とか・・・。
あと、LBをSOCにかえただけで上手くいった時もあるよ。

167 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 03:49
Stratageneだかが出してたBlunt cloning kit試してみるとか。
TAクローニング並に簡単だ。
それとなんだかんだ言っても、pET/BL21(DE3)は、163も言ってるが、もれるよ。

168 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 10:12
162です。
出来れば、私の方にもアドバイス下さい。
15kbはラムダフアージのインサート部分(ノット1切り出し)です。

そもそも15Kb位のものを入れた前例などが、あるのかどうか
だけでも知りたいです。

169 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 10:37
>>168
p300が入ったベクターがあるんだから15kくらい入るんじゃないの

170 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 12:24
そうですか、有り難うございます。

171 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 15:57
自分は23k入れたことがあります。知り合いには30k入れた人もいる。

172 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 16:31
>168
NotIだとかえって結構むずかしいよね。
インサート:ベクター比をいろいろ変えて試してみてくだされ。
漏れの使った大腸菌はSTBL2(Gibco)でした。

173 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 17:50
>>171
そういうの聞くと、15Kなんて何でもない様な気がしてきます。
有り難うございます。

>>172
えっ、そんなんですか?
ノットは糊しろの部分が多くて、くっつきやすいような
気がしてたので、、。

とりあえずいろいろやってみます。
有り難うございます。

174 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 22:46
>173
糊しろが長い分だけセルフライゲーションも起きやすいから。

175 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 23:01
>>173-174
糊しろって突出の部分の事?EcoRIとかと同じく4 baseですが…
何か勘違いしておられるのでは?

176 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/27 02:32
40K入れたこと有るけど。

でもDeletionおきちゃうんだよ、大腸菌飼っているウチに。
バッサリ20k位飛んだりする。

177 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/27 02:55
これを見ると200kbぐらいでも入るみたいですね
order.lifetech.com/lti_store/flow.icl?sku=11635018
って、全然BlueScriptじゃないやん・・

178 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/27 17:15
>>169
随分遅いつっこみだが、p300は9Kもないので、一応。

179 :Chromosome:02/02/28 03:43
染色体標本つくりで1つ教えてください。
固定するときにカルノア液を使いますが、なぜメタノールだけじゃいけないんでしょうか??
酢酸はどのような作用をしているのでしょう??
教えてください。

180 :関東以南:02/02/28 22:59
西洋ワサビぺルおきしたーぜによる化学発光基質でお薦めありませんか?
あるふぉすにはCDP-Star使ってるんですが。

181 ::02/03/01 01:51
やっぱりDABじゃないの?それ以外使ったことな〜し。

182 :名無しのどりー:02/03/01 02:07
cosmidの扱い方書いた本ってどなたかご存じないっすか。
phageやplasmidは多いんだけど・・・。

183 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/01 19:07
サザンのコツ教えてください。
アルフォス・CDP−Starを使っています。
全然うまくいかないんです。お願いします。

184 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/01 19:12
上手にクリックできないんです
『クリックで救える命がある、、、らしいです。』
http://www.dffmedia.com/index.html


185 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/01 19:53
>>182
ライブラリーを作るのでなければ、通常のプラスミドと変わらない。

186 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/01 20:27
こんにちは。
ミントメールというのをご存知ですか?
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(住所は正確に入力して下さい。この住所に小切手を送ります)
- City*: 都市名 → TOUKYOUTO, JAPAN
- State*: そのまま
- Zip*: 郵便番号 → 000-0000
- Country*: 国 → JAPANを選択
- Phone*:電話番号 → 国家番号(日本):81 + 地域番号の前0を除いた電話番号
03-1111-1111 → 81-3-1111-1111,090-1111-1111 → 81-90-1111-1111
- Fax:書かなくてもいいです。
- E-mail*: メールアドレス(全てがメールで処理されるから正確に書いてください)
- Confirm E-mail*: メールアドレスもう一回入力
- Year of birth*: 出生年 → 1970
- Gender*: 性別 → Male(男性), Femaie(女性)
- Password*: 暗証番号 (6文字以上)
- Confirm Password: 暗証番号確認, 上記と同じ
- how do you want to receive commissions that you earn?プレゼント選択
*gift certificates(double$$) プレゼント券(2倍) *cash現金
- do you want to be notified when your referrals sing up?*あなたの会員が登録された場合お知らせしますか?
 yes を選 択
- 興味ある分野10個まで選択します。(10個以上だった場合、エラーになるから10個まで)

- Submitをクリックすれば画面に thank youというメッセージと一緒にあなたのID番号と
 暗証番号が出ます。そして5分以内にあなたのメールアドレスに加入完了のメールが届きます。


187 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/02 01:48
>183
どういう風にうまくいかないん?
ちなみに俺それ使ったことあるけど最悪やった。
実験めっちゃ遅れてしまったよ・・・代えれるならRIか
ジゴケシゲニンにしな。

188 :183:02/03/07 18:51
>187
メンブランにDNA断片が転写されないんです。
転写後のゲルをエチブロ染色してみると
かなりDNA断片が残ってしまっています。
ちなみにゲル1平方センチメートル当たり
3mAで3時間かけて転写してます。
ちなみに転写の前に酸・アルカリ処理はしてません。
何かアドバイスありましたらお願いします。
ポジティブはシグナルでるので試薬のせいではないと思います。


189 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/07 19:15
>>188
電気じゃなくてキムワイプでやってみるのはどうですか?

190 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/11 07:59
皆さんは細胞への遺伝子導入は何を使われていますか?
とある遺伝子をレトロウィルスで発現させてみると、抗生物質に耐性になって
抗生物質を含んだメディウムで細胞が増えるのですが、ウェスタンで確認すると
全く発現していないんです。
10クローンくらいつくると、そのうち1つがわずかに発現している程度。
何故なんでしょう?
アデノウィルスがもっと強力だ、って聞いたんですけど、どうなんですか?

191 :名無しゲノムのクローンさん :02/03/11 08:57
>>188
>ちなみに転写の前に酸・アルカリ処理はしてません。
なにか理由でもあるの?サイズの大きい断片は当然転写される効率下がるんだけど。
どうしても酸処理したくなければ制限酵素の種類変えるなりしてハイブリするはずの
断片を短くするなどすれば大丈夫でしょ。



192 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/11 10:50
>>190
抗生物質耐性になっていることからプロウイルスDNAのintegration&遺伝子発現自体はOK.
「とある遺伝子」はプロウイルスDNAから欠失していませんか?
transientでは「とある遺伝子」発現はどうでしょうか?

193 :190:02/03/11 10:57
>>192
resありがとうございます。
「プロウィルスDNAから欠失」とは、パッケージ細胞そのものに
その遺伝子がない、ということでしょうか?
実験でレトロウィルスをよく使うのですが、その原理に関しては
いまいちよくわかっていないので申し訳ありません。

194 : :02/03/11 13:06
>>188
普通にキムタオルで転写しろ。
馬鹿。

195 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/11 18:14
>>190
1割も発現してるなら喜ばなくてはいけない場合もあると本で読んだ。
2割発現したらラボ全体で祝賀会するような細胞もあるとか。

196 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/11 18:22
それに、レトロはゲノムに組み込まれるからずっと安定した発現が得られる、というのが
原則なのに、実際は一時的な発現のことも多し。
なぜだろう。人体の神秘やなぁ。

197 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/11 22:33
>196
DNAメチル化です。

198 :192:02/03/12 03:19
>>193
おバカ。少しはレトロウイルスを勉強してから使ってね。

>「プロウィルスDNAから欠失」とは、パッケージ細胞そのものに
その遺伝子がない、ということでしょうか?

なんじゃそりゃ?integrateしたgeneに目的遺伝子が確かにあるかPCRで確認
したかってこと。メチル化の場合もあるだろうし、目的遺伝子がtoxicであったり
するとdefective mutationが入ったcloneだけが取れてきている可能性もある。

ベクターウイルスを感染させて1〜2日後に遺伝子発現がないようだったら
ベクターコンストラクト自体がちゃんと出来てないって事もありうる。
MOI of 1くらいにしてウエスタンにて試してみれ。


199 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 10:35
みんな実験してねぇのか?

200 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 18:32
うまく行ってるんだよ。

201 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 21:22
最近プラスミドがまともに取れないのですが、
何が原因がわからず苦悶しております。

キアゲンのミニプレップやってるんですが、
プラスミドを泳動するとなんかはるか上の方にバンドが
出るのです(10kbよりも上)。
そんでなんだこれ?と思って制限酵素(一箇所)
で切って流すとサイズ通りのバンドが一本きちんと
出ます。

これってプラスミドDNAの高次構造がおかしくなってる
ってことなんでしょうか?
試薬のpHはおかしくはないのですが、何が原因と
考えられるでしょうか?


202 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 00:14
大歩危間違い or circular/linear

203 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 00:52
こんかたまー?

204 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 02:26
どう見てもゲノムのコンタミだろ。cultureのvolumeが大き過ぎるか、Sol2入れた後で激しく振り混ぜ過ぎ。

205 :201:02/03/23 10:24
ゲノムのコンタミだったら制限酵素処理した後で
1本のバンドになるとは思えないんですけども。
P2入れた後はかなりケアして5回くらいinvertさせる
だけです。

ちなみに昨日もう一回培養してプラスミドを取ったら
普通のバンドが出てきました。

原因はいまだに不明。

206 :670:02/03/23 11:33
3回 invertで充分と思われ

ところでプラス実度がちゃんとトランスフォームされてるの?

207 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 12:15
>>205
切った奴もう一度ligationしてみたらどうよ?
工事構造ならまた上の方のバンドが復活するかも。

208 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 13:04
>>201
んなこと良くあるよ。高次構造だ。
エクス寅が一本どころか5本くらい出てきて驚くこともある。

209 :201:02/03/23 13:21
>>208

よくあることなんですか?それは驚き。

ちなみに今朝またプラスミドを取ってみましたが、
比較的まともな感じでした。
でもハイパーコイルっぽいバンドはないです。
制限酵素で今きってる最中ではありますが。
また、midiでも今取っている最中です。

>>207

切った奴をまたライゲーションですか。
試しに1サンプルだけやってみます。


210 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 13:32
>>205
ゲノムのコンタミは制限酵素処理で切れてスメアになるが、プラスミド
のバンドに比べて薄いから見えないんでしょ。
ゲノムのコンタミの理由としては、プラスミドが大腸菌にtoxicで、溶菌
してるって可能性も。

211 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 14:14
ビタミンCを用いて、ストレス性胃潰瘍を緩和させる
実験を、マウスを使ってやりたいと思ってる者ですが、
この場合のビタミンCの有効量がわかる人はいませんか?

212 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 21:28
マウスってビタミンCを自分で作っているって聞いたことがあるような気がする
のですが。

213 :211:02/03/23 22:27
>212
マウスを24時間絶食させた後に、水につけることで
マウスに人工的に胃潰瘍を作ってビタミンCの効果をみようと
しています。その際どれだけのビタミンCの投与で、マウスに上記の
ストレスを与えても、胃潰瘍を発症しないかを知りたくて、文献を調べた
のですが、その有効量がのっているものが見つからなくて困っています。

214 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/24 00:06
夏休みの自由研究レベルの実験だな…

215 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/24 01:17
>>212
その通り。マウスは自分で合成できる。
犬や猫など、他の殆どの動物も合成できる。
できないのは人・猿・モルモット。
ラットはビタミンC要求性の品種があるそうだ。
正直、>>211の前途には涙を禁じ得ない。
http://www.clea-japan.co.jp/animals/b4-top.htm
http://group.lin.go.jp/data/zookan/kototen/spacial/s004.htm
http://www.asahi-net.or.jp/~bh2h-ooby/usaginoheya.htm

216 :sage:02/03/24 02:20
>>212
有効量を明らかにする実験ではないのですね。
なんかアスコルビン酸を飲ませると「スッパスッパ」ってマウスが嫌がるらしい。

217 :211:02/03/24 04:09
いろいろとご意見ありがとうございます。
やっぱりこの実験は無理そうですね。

218 :215:02/03/24 05:05
>>217
感謝の気持ちがあるなら後学のために聞かせれ。
学年(学部、M、D)と学科(生物、薬学、家政、etc)。
あとその実験は自分だけの思いつきか、教官がやれと言ったのか。

219 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/24 10:31
193なんですが、レトロウィルスで遺伝子を発現させると非常に強く発現するのですが、
飼っているうちに次第に発現が弱くなっていき、最後には消えてしまいます。
免疫染色で確認すると、全ての細胞が弱くなってきているのではなく、all or nothing
のようです。もちろん、選択する抗生剤入りのミディウムで飼っていますが。
これってやっぱりメチル化なんでしょうか?

220 :211:02/03/25 03:17
>218
薬学部の二年生です。
クラブ活動で簡単な実験ができるので、
今年はこんなことをやろうかなと思って書きました。

221 :hh:02/03/25 11:04
>211 まだ見てるか?このすれ。

マウスVC合成→VC投与意味なし。
なんでこう結論できるのかい?
もっと柔軟に考えるべきよ。

たとえば、必須アミノ酸。
それだけとってりゃあとのアミノ酸は不要という意味か?
確かにそれ以外は合成できるけど、外から摂取したほうが
効率いいし、生体は実際それを利用してる。

ただ、部活なら、お奨めできる研究発想じゃないな。
はいて捨てるほどの研究者でそんな計画立てるの30年前ならともかく意味なし。

まじめに考えるなら
VCとの複合要因(同時摂取の栄養素など)を
加味するなど、変更すればまだまだやられていないこと多いが、
むしろ、
お遊びにならない程度なら
地域性や特殊な状況を計画に加えるといいと思う。

低インスリンダイエットみたいなものを否定できないところなど、
栄養学は他分野に較べ10年位は研究が遅れているところを
さらけ出したともいえる。
付け込む余地はあるともいえるな。



222 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/03 20:31
age

223 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/03 20:48
こんなのはどお?
http://www.media-0.com/www/smile/iriki.html

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